劉恒++蔣向輝

摘要：采用不同濃度的赤霉素、低溫層積、溫水浸泡等方法對金銀花（Lonicera japonica Thunb.）種子進(jìn)行處理，并測定其發(fā)芽率，同時采用石蠟切片法觀察經(jīng)沙藏處理后的種子解剖結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，金銀花種子經(jīng)100 mg/L的赤霉素處理12 h后發(fā)芽率最高；金銀花種子經(jīng)20 ℃沙藏40 d后發(fā)芽率最高；40 ℃以上溫水處理對金銀花種子有不同程度的損害，25 ℃清水浸泡對金銀花種子發(fā)芽有一定的促進(jìn)作用；在低溫層積過程中，金銀花種子逐漸完成后熟過程，胚細(xì)胞中逐漸積累多糖顆粒，同時隨著層積時間的延長，種子薄壁細(xì)胞逐漸增大，種皮解體，胚乳中的營養(yǎng)成分逐步分解，提供種子萌發(fā)所需要的物質(zhì)與能量，而高溫層積對胚的發(fā)育表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：金銀花（Lonicera japonica Thunb.）種子；萌發(fā)；解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S567.7+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4221-04

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）又名忍冬，為忍冬科忍冬屬（Lonicera）植物，在中國主產(chǎn)于山東、河北、河南、貴州、湖南、四川等省。金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用，常用于治療癰腫疔瘡、熱血毒痢、風(fēng)熱感冒與瘟病發(fā)熱等癥[1]。金銀花是很多消炎解毒藥的主要原料，中醫(yī)處方有約三分之一要用到金銀花，目前以金銀花為原料的中成藥已達(dá)200多種，而且隨著以金銀花為主要原料的飲料、保健品和日用化工品的開發(fā)，金銀花的經(jīng)濟(jì)價值更加凸顯。

目前，關(guān)于金銀花的研究主要集中化學(xué)成分及藥理研究方面[2，3]。金銀花種子屬于深休眠類型，在自然條件下，需要越冬才能萌發(fā)[4]。金銀花種子在自然條件下絕大部分將被菌類侵襲、動物捕食與破壞以及其他物理、化學(xué)因素破壞，導(dǎo)致其種子質(zhì)量差、后熟時間長，對其有性生殖過程造成了嚴(yán)重的影響。至今為止，對解除金銀花種子休眠方法的研究已有報道[5]，但對其休眠機(jī)理、休眠解除機(jī)制以及萌發(fā)過程中解剖結(jié)構(gòu)變化等方面的研究仍缺乏系統(tǒng)的資料。本研究采用不同的方法對金銀花種子進(jìn)行誘導(dǎo)萌發(fā)處理，對有效打破金銀花種子休眠的方法進(jìn)行了探索，同時對種子萌發(fā)過程中形態(tài)特征及物質(zhì)消化情況的變化進(jìn)行了比較研究，以期為深入揭示金銀花種子休眠形成的機(jī)理和解除休眠的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金銀花種子采自山東省蒼山縣巨花一號金銀花種植基地，種子黑色、長橢圓形，寬度0.16～0.22 cm、長度0.25～0.32 cm，千粒重15.7±0.44 g，含水量6.7%。

1.2 試驗方法

1.2.1 回濕處理 在萌發(fā)試驗前參照鄭光華[6]的方法，采用逐級回濕平衡水分法進(jìn)行回濕處理。

1.2.2 赤霉素處理 50、100、200 mg/L的赤霉素各處理6、12、18 h。以未經(jīng)任何處理的種子作為對照（CK1），每組50粒種子，記錄發(fā)芽的種子數(shù)。

1.2.3 沙藏處理 10、20、30 ℃各沙藏10、20、30 d。室溫（25 ℃）下的種子作為對照（CK2），每組50粒種子，記錄發(fā)芽的種子數(shù)。

1.2.4 溫水處理 40、60、80 ℃的水各處理2、4、6 h，并用室溫（25 ℃）清水浸泡的種子作為對照（CK3），每組50粒種子，記錄發(fā)芽的種子數(shù)。

1.2.5 發(fā)芽率的統(tǒng)計 經(jīng)不同處理后的種子，置于裝有濾紙（保濕）的培養(yǎng)皿中，以胚根長度大于2 mm的統(tǒng)計為萌發(fā)，15 d統(tǒng)計結(jié)束。發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/測定種子數(shù)）×100%。試驗結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，用t檢驗分析差異顯著性，用Levene Test方法檢驗數(shù)據(jù)的方差齊性，用單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（Duncan）方法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。

1.2.6 石蠟切片 取經(jīng)不同溫度沙藏處理后的金銀花種子，除去種皮，用FAA固定液浸漬種子24 h，用自來水洗去固定液，用愛氏蘇木精染液進(jìn)行染色24 h，水洗至不見浮色，加2%氨水處理20 min，再水洗，采用乙醇梯度脫水，用乙醇與二甲苯（1∶1）混合液脫去乙醇。將上述種子浸入純石蠟中，通過在40 ℃溫箱中過夜進(jìn)行浸蠟，然后進(jìn)行包埋，干燥2～3 d后進(jìn)行切片。將黏液涂于洗凈的載玻片上，把切好的薄片貼在上面，40 ℃溫箱中烤片，用二甲苯進(jìn)行脫蠟，涂上中性樹膠，蓋好蓋玻片，在10×10倍熒光顯微鏡下觀察并攝影。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度赤霉素對金銀花種子發(fā)芽率的影響

赤霉素是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，對于種子內(nèi)含有抑制物質(zhì)或缺乏內(nèi)源促進(jìn)物質(zhì)的種子有重要的生長調(diào)節(jié)作用。從圖1可知，采用赤霉素處理的金銀花種子發(fā)芽率有很大的提高，其種子發(fā)芽率最高可達(dá)44%。100 mg/L與200 mg/L赤霉素處理差異不大，但100 mg/L與50 mg/L的赤霉素處理差異顯著，表明最適合金銀花種子發(fā)芽的赤霉素濃度在100～200 mg/L之間。傅強(qiáng)等[7]研究認(rèn)為，用赤霉素浸種在一定程度上可以調(diào)節(jié)種子內(nèi)的激素平衡，促進(jìn)生長類激素含量增加，從而打破種子休眠。但是隨著赤霉素濃度的升高，處理時間的延長，發(fā)芽率也呈現(xiàn)一定的下降趨勢，這也說明了高濃度的赤霉素對金銀花種子萌發(fā)有一定的抑制作用。因此，誘導(dǎo)金銀花種子萌發(fā)時，赤霉素濃度以采用100 mg/L處理12 h較為合適。

2.2 不同沙藏溫度對金銀花種子發(fā)芽率的影響

低溫層積處理是通過構(gòu)建低溫、濕潤、通氣等條件來解除種子休眠的常用方法。本研究通過金銀花種子與濕沙混合，對金銀花種子進(jìn)行不同溫度與不同時間的低溫層積處理，從圖2可知，10 ℃低溫短時間層積處理對種子萌發(fā)的誘導(dǎo)作用不明顯，甚至發(fā)芽率比對照還要低，但經(jīng)低溫長時間沙藏處理的種子發(fā)芽率比未經(jīng)沙藏處理的種子發(fā)芽率明顯要高，尤其在沙藏溫度為20 ℃，處理40 d后發(fā)芽率最高，表明這一條件下能最有效地解除金銀花種子的休眠。隨著沙藏溫度的升高，金銀花種子的發(fā)芽率降低，表明高溫環(huán)境不利于金銀花種子的萌發(fā)。已有多項研究表明，種子的低溫層積可導(dǎo)致種子吸水能力加強(qiáng)、細(xì)胞滲透性提高、不溶物轉(zhuǎn)化為可溶物。裴東等[8]研究認(rèn)為，層積催芽能促使種子合成GA和細(xì)胞分裂素等生長激素，降解或轉(zhuǎn)化ABA等抑制激素。本研究結(jié)果顯示，低溫層積與GA的合成與利用之間存在一定的相關(guān)性，相關(guān)性大小及相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.3 不同水溫度對金銀花種子發(fā)芽率的影響

從圖3可知，40 ℃以上的水對金銀花種子有不同程度的損害，而且隨著時間的延長和水溫的升高，損害越來越大，40 ℃水處理6 h以后，種子發(fā)芽率在5%以下，水溫為60 ℃時，金銀花種子活力基本喪失。本研究另外通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，用室溫（25 ℃）清水處理的種子發(fā)芽率比未經(jīng)任何處理的要高很多，這可能與清水浸泡能有效增加種子的含水量有關(guān)，種子含水量增加能有效促進(jìn)種子的生理代謝，縮短休眠時間，從而提高發(fā)芽率。

2.4 不同沙藏處理對金銀花種子胚解剖結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可以看出，金銀花種子種皮較厚，由3～4層細(xì)胞構(gòu)成，胚乳發(fā)達(dá)，胚較小。金銀花種子在10 ℃沙藏處理前期，胚乳細(xì)胞與外層薄壁細(xì)胞排列緊密，隨著低溫處理時間的延長，胚乳細(xì)胞與薄壁細(xì)胞出現(xiàn)膨大、變形、細(xì)胞間分界不清的現(xiàn)象，淀粉粒分布散亂，細(xì)胞變形破裂，表明胚的萌動能力逐漸增強(qiáng)。在20 ℃沙藏處理前期，胚的淀粉粒均為單粒卵圓形，分布均勻，體積大小基本一致。隨著處理時間的延長，淀粉粒形態(tài)分化較大，分布散亂，胚內(nèi)部細(xì)胞染色明顯增強(qiáng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)分化明顯，蘇木精染液是生物活性染色劑，染色效果的增強(qiáng)表明沙藏增強(qiáng)了金銀花種子內(nèi)部組織活性，結(jié)果表明，金銀花種子具有一定的生理后熟作用，需在低溫濕潤條件下貯存一段時間后才能順利萌發(fā)。從圖4還可以看出，20 ℃沙藏40 d后的種子與其他處理的種子相比，胚分化明顯提前，能有效加劇金銀花種子淀粉粒的消耗和提高胚的活力。30 ℃沙藏處理20 d后胚根能正常分化，40 d后胚根逐步形成，但30 ℃沙藏60 d后胚根逐步失去活性，生長停止。從圖4中還可以看到，近胚根端的胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁先降解，而近子葉端的胚乳細(xì)胞中細(xì)胞壁降解相對滯后，由此可以判斷近胚根端的胚乳細(xì)胞比近子葉端的胚乳細(xì)胞的生命活動更加旺盛。

3 小結(jié)與討論

3.1 影響金銀花種子活力及細(xì)胞完整性的因素

植物種子的活力與種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性緊密相關(guān)，種子在采收、貯藏與催芽過程中，如造成細(xì)胞膜的損傷、細(xì)胞器的畸變等都將導(dǎo)致種子活力的變化[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)金銀花種子的種皮細(xì)胞外有層厚厚的脂質(zhì)層，而脂質(zhì)層的疏水特性決定種子不易受到水分影響而難于吸水萌發(fā)。隨著水溫升高，能加快脂質(zhì)層的溶解，種皮向外形成突起，導(dǎo)到種皮與胚之間出現(xiàn)空隙，這些都可以提高種胚的活力，促進(jìn)種子的萌發(fā)。但隨著水溫的進(jìn)一步升高，導(dǎo)致種子含水量下降、胚軸內(nèi)部細(xì)胞出現(xiàn)變形及結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞、淀粉粒破裂，加劇了種子內(nèi)部維管束組織和薄壁細(xì)胞活性的喪失，對外部細(xì)胞及種皮也產(chǎn)生不良的影響，趙鵬等[10，11]研究認(rèn)為，這種不良影響主要表現(xiàn)為種子相對電導(dǎo)率的上升，正是由于種子內(nèi)部細(xì)胞活性的喪失和結(jié)構(gòu)完整性的破壞導(dǎo)致了種子活力的下降。

3.2 淀粉?；钚院蛿?shù)量的變化對金銀花種子活力的影響

淀粉粒作為細(xì)胞主要能量和碳架貯藏庫，其數(shù)量、形態(tài)的變化和活性的喪失，能夠反映植物生長發(fā)育的能量變化情況[12]。程紅焱等[13]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉粒數(shù)量的減少、淀粉粒的變形破裂以及活性的喪失加速了種子細(xì)胞的老化劣變，影響種子活力。本試驗研究表明濕水處理和沙藏處理中，隨貯藏溫度的升高，金銀花種子細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量減少、活性逐漸喪失，萌發(fā)種子的胚根長變短，尤其在50 ℃水處理和30 ℃沙藏后處理后，種子細(xì)胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量顯著減少，萌發(fā)試驗中不具萌發(fā)力的種子增多且出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，能夠萌發(fā)的種子其萌發(fā)后胚根縮短，且伴隨有胚根腐爛的現(xiàn)象，這些都源于種子內(nèi)部細(xì)胞活性的喪失及結(jié)構(gòu)的損傷。金銀花種子在20 ℃以下低溫沙藏處理時，種子發(fā)芽率和能量保持能力強(qiáng)，有效地保持種子細(xì)胞活性及結(jié)構(gòu)完整性，并且在此溫度下，淀粉粒數(shù)量隨溫度升高而呈上升的趨勢。因此，10 ℃或20 ℃沙藏處理能有效促進(jìn)金銀花種子的萌發(fā)，而以20 ℃沙藏處理40 d效果最好。

3.3 胚乳細(xì)胞中的脂質(zhì)小泡的變化對金銀花種子萌發(fā)的影響

從圖4可以看出，金銀花種子胚乳中充滿著脂質(zhì)小泡。這些脂質(zhì)小泡作為金銀花種子胚乳中的主要貯藏物質(zhì)，在整個層積過程逐步地分解以提供種子萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，而通常種子中的主要儲藏物質(zhì)是淀粉，是通過淀粉的分解來提供養(yǎng)分。從圖4E可以看出，金銀花種子在層積了40 d后，胚乳細(xì)胞中的脂質(zhì)小泡逐漸降解，液泡開始形成，圖中的黑色粒狀結(jié)構(gòu)可能是脂粒或蛋白質(zhì)，由于脂?；虻鞍踪|(zhì)染色較深，顯微鏡下呈黑色，這個時期蛋白質(zhì)形成是種子萌發(fā)生長的明顯標(biāo)志。金銀花種子層積60 d后，淀粉進(jìn)一步地分解，由大顆粒分解為小顆粒，脂粒也出現(xiàn)分解的現(xiàn)象，這主要是由于種子的生理活動需要更多的養(yǎng)分供應(yīng)，要求胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷地分解為容易運(yùn)輸和吸收的小分子的物質(zhì)，正是胚乳細(xì)胞地脂質(zhì)小泡的解體，提供了種子進(jìn)一步代謝活動所需要的營養(yǎng)。

植物種子萌發(fā)時，一般是胚根的分生細(xì)胞先分裂、伸長，在土壤中形成根，然后下胚軸伸長，將胚芽推出地面，長成幼苗[14]，金銀花種子的萌發(fā)過程與此基本一致，在這處過程中，低溫層積條件對金銀花種子萌發(fā)有至關(guān)重要的意義，層積開始時細(xì)胞質(zhì)膜逐漸分解、脂質(zhì)小泡分解形成液泡、大的淀粉顆粒逐步分解為小的個體等，這些都表明在低溫層積過程中金銀花胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)不斷地分解以提供種子萌發(fā)生長所必需的養(yǎng)分。因此，研究胚乳內(nèi)含物的變化情況可以弄清金銀花種子萌發(fā)的進(jìn)程，從而找到有效打破金銀花種子休眠的方法。

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