李　覓，鄧　杰，楊躍寰，衛(wèi)春會(huì)*，黃治國(guó)，羅惠波，葉光斌，楊曉東，黃志瑜

（1.四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；2.江安縣工業(yè)園區(qū)管理委員會(huì)，四川江安644200；3.四川省釀酒研究所，四川廣漢610000）

真菌毒素在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的安全性檢測(cè)

李覓1，鄧杰1，楊躍寰1，衛(wèi)春會(huì)1*，黃治國(guó)1，羅惠波1，葉光斌1，楊曉東2，黃志瑜3

（1.四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；2.江安縣工業(yè)園區(qū)管理委員會(huì)，四川江安644200；3.四川省釀酒研究所，四川廣漢610000）

該研究采用酶聯(lián)免疫法對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的各個(gè)樣品（大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒）中的相關(guān)真菌毒素進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明：黃曲霉毒素B1在大曲、酒醅、丟糟和黃水中的含量分別為2.55 μg/kg、1.75 μg/kg、1.95 μg/kg和2.25 μg/kg，在基酒和成品酒中的含量未達(dá)到檢出水平；赭曲霉毒素A在大曲、酒醅、丟糟和黃水中的含量分別為1.50 μg/kg、1.65 μg/kg、1.80 μg/kg和2.05 μg/kg，在基酒和成品酒中的含量未達(dá)到檢出水平；桔霉素在6種樣品中均未檢出。樣品中3種真菌毒素均未超過(guò)國(guó)家發(fā)酵食品限量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫法穩(wěn)定性較高，適用于白酒生產(chǎn)過(guò)程中各個(gè)樣品的定量分析。

酶聯(lián)免疫法；真菌毒素；濃香型白酒；安全性

真菌毒素作為相關(guān)微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，一直以來(lái)都是食品行業(yè)的安全隱患，以黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）、桔霉素（citrinin）最為常見。黃曲霉毒素B1是一種劇毒和強(qiáng)致癌物質(zhì)，其毒性更勝于氰化鉀和砒霜，極易污染糧食作物、肉類以及奶制品等［1-2］，黃曲霉毒素的熔點(diǎn)較高（265～269℃），高溫條件下結(jié)晶狀態(tài)較為穩(wěn)定［3］。赭曲霉毒素A廣泛存在于各種食物，谷物以及調(diào)味品、酒類等副產(chǎn)品中，具備強(qiáng)致癌、致畸和致突變性，微溶于水，極易溶于有機(jī)溶劑，對(duì)光和空氣不穩(wěn)定，對(duì)腎臟和肝臟的危害性極大［4-5］。桔霉素主要由紅曲霉代謝產(chǎn)生，易出現(xiàn)在食品行業(yè)與糧食作物上，對(duì)腎臟毒性比較明顯，造成的損傷不可修復(fù)。

糧食作為白酒釀造的主要原料，被真菌毒素污染糧食極有可能進(jìn)入釀酒工業(yè)，再考慮到白酒生產(chǎn)涉及面廣泛，包括飼料、肥料、食品、板材、曲藥等行業(yè)［6-7］，白酒行業(yè)中的真菌毒素應(yīng)該引起高度重視。目前，快速檢測(cè)樣品中真菌毒素的方法較多，如薄層色譜法（thin layer chromatography，TCL）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA）、免疫生物傳感器技術(shù)（immunobiosensor technique）、蛋白芯片技術(shù)（proteinchiptechnology）和分子印跡技術(shù)（molecularimprintingtechnology，MIT）等方法，但有的方法考慮到檢測(cè)的精確性需要借助于大型檢測(cè)儀器，如薄層色譜法和膠體金免疫層析法要借助高效液相檢測(cè)［8］，而有的方法成本高，同時(shí)對(duì)檢測(cè)條件和技術(shù)要求高，如免疫生物傳感器技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)和分子印跡技術(shù)等方法。酶聯(lián)免疫法是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，在疾病診斷大分子檢測(cè)中廣泛使用，在食品安全檢測(cè)污染小分子也運(yùn)用廣泛［9］，特別是在調(diào)味品、葡萄酒等行業(yè)中已經(jīng)成熟引入酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢驗(yàn)。該研究建立了靈敏、準(zhǔn)確、快速、高通量的白酒真菌毒素混合污染檢測(cè)方法，不僅具有學(xué)術(shù)意義，更是符合社會(huì)白酒產(chǎn)品及副產(chǎn)物質(zhì)量安全檢測(cè)的需求和應(yīng)用前景，對(duì)保障白酒生產(chǎn)和安全消費(fèi)具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樣品：成品大曲、入窖酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒，取自瀘州老窖40年窖齡窖池的樣品編號(hào)為：大曲1、酒醅1、丟糟1、黃水1、基酒1、成品酒1；來(lái)源于100年窖齡窖池的樣品編號(hào)為：大曲2、酒醅2、丟糟2、黃水2、基酒2、成品酒2。

氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、吐溫-20、二氯甲烷、甲醇、三氟乙酸等（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

酶聯(lián)免疫試劑盒、桔霉素免疫親和層析柱、赭曲霉毒素A免疫親和層析柱、玻璃纖維濾紙等：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

5430高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；SB-350型多功能高速粉碎機(jī)：上海廣沙工貿(mào)有限公司；Precellys 24高速勻質(zhì)器：法國(guó)Bertin公司；AR2140電子分析天平：上海托利多儀器有限公司；BF-2000M氮?dú)獯蹈蓛x：北京八方世紀(jì)科技有限公司；1500酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3方法

1.3.1試劑的配制

黃曲霉毒素B1樣品提取液：將甲醇和去離子水按體積比2∶3混合，用于提取樣品中的黃曲霉毒素B1；

赭曲霉毒素A樣品提取液：將甲醇和去離子水按體積比8∶2混合，用于提取樣本中的OTA；

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：8 g NaCl，1.2gNa2HPO4，0.2gKH2PO4，0.2gKCl，混合用990mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1 000 mL；

清洗緩沖液：25 g NaCl、5 g NaHCO3和0.1 mL吐溫-20混合，然后用蒸餾水稀釋至1 000 mL；

NaOH溶液：稱取80.0 g固體NaOH，用蒸餾水定容至1 000 mL；

三氟乙酸水溶液：取0.5 mL的三氟乙酸，用去離子水定容至1 000 mL，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2.5；

桔霉素樣品稀釋液：取500 mL三氟乙酸水溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5；

桔霉素洗脫液：將甲醇與三氟乙酸水溶液按體積比7∶3混合配成樣品洗脫液。

1.3.2樣品前處理

（1）黃曲霉毒素B1的提取［10］

固態(tài)樣品（大曲、入窖酒醅和丟糟）前處理：在8 mL提取液中加入1 g粉碎樣品，混合均勻（大約振蕩10 min），然后3 500 r/min常溫離心5 min，取1.28 mL上清液，用二氯甲烷提取2次，（每次用量2 mL，振蕩5 min，分層后取下層二氯甲烷相），合并二氯甲烷相；將提取步驟中得到的二氯甲烷相于50℃下氮?dú)鉂饪s吹干，加入0.2 mL甲醇，振蕩混勻，用去離子水按1∶7比例稀釋（每體積處理后溶液加入7倍體積去離子水），取稀釋后液體待測(cè)。

液態(tài)樣品（黃水、蒸餾酒、基酒和成品酒）前處理：需用樣品1 mL，直接如樣品前處理方法1中兩次二氯甲烷提取，然后將提取相于50℃下氮?dú)鉂饪s吹干，加入甲醇0.4 mL，振蕩混勻，用去離子水按1∶9比例稀釋（每體積處理后溶液加入9倍去離子水），取稀釋后液體待測(cè)。

（2）赭曲霉毒素A的提取

固態(tài)樣品前處理：將10 g粉碎樣品和20 mL提取液混合，再加入1 g NaCl，以勻質(zhì)器高速攪拌2 min（1 000 r/min以上即可），4 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液并加入40 mL PBS緩沖液，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，得到濾液；

液態(tài)樣品前處理處理：取5 mL樣品脫氣后加入2.5 g NaCl與45 mL PBS緩沖液混勻，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，得到濾液。

純化步驟按照國(guó)標(biāo)GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》的方法進(jìn)行處理［11］。

（3）桔霉素的提取

固態(tài)樣品前處理：取10 g粉碎樣品溶于20 mL樣品提取液，劇烈振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液并加入40mL樣品稀釋液，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，得到濾液。

液態(tài)樣品前處理處理：各取5 mL樣品液，加入45 mL樣品稀釋液，振蕩混勻后用玻璃纖維濾紙過(guò)濾、備用。

純化步驟按照SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的測(cè)定方法免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》的方法進(jìn)行處理［12］。

1.3.3毒素的檢測(cè)

按照各種酶聯(lián)免疫試劑盒提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與結(jié)果計(jì)算

（1）百分吸光度值的計(jì)算

百分吸光度值按以下公式計(jì)算：

式中：B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液的平均吸光度值；B0為濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與各樣品濃度的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為各個(gè)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值（x），縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率（y），測(cè)定出的樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)樣品真菌毒素濃度。

1.3.5方法評(píng)價(jià)

對(duì)實(shí)驗(yàn)中酶聯(lián)免疫法用于測(cè)定各樣品中真菌毒素含量的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，以精密度和回收率為指標(biāo)。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A以及桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，3條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別在相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值范圍內(nèi)與百分吸光度值線性關(guān)系良好。

圖1　黃曲霉毒素B1（a）、赭曲霉毒素A（b）及桔霉素（c）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of aflatoxin B1（a），ochratoxin A（b）and citrinin（c）

2.2各標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)

對(duì)黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)樣品、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)樣品和桔霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，按照酶聯(lián)免疫試劑盒提供的檢測(cè)步驟，結(jié)果如表1所示。

表1　真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果Table1 Determination results of mycotoxins standard samples

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)要求，各標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)＜10%符合使用要求，由表1可知，不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)均＜10%，完全符合酶聯(lián)免疫試劑盒的使用要求。

2.3各樣品中毒素的含量

2.3.1黃曲霉毒素B1的含量

分別對(duì)12個(gè)樣品進(jìn)行前處理，用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值，獲得的OD值數(shù)據(jù)用該劑盒提供的RIDAWIN軟件分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同樣品的黃曲霉毒素B1含量Fig.2 Contents of aflatoxins B1in different samples

由圖2可知，本試驗(yàn)所測(cè)定的黃曲霉毒素B1在大曲中的含量分別為2.5μg/kg和2.6μg/kg，入窖酒醅中分為1.7μg/kg和1.8 μg/kg，丟糟中分別為1.9 μg/kg和2.0 μg/kg，黃水中分別為2.2 μg/kg和2.3 μg/kg，基酒和成品酒樣品中黃曲霉毒素B1的含量均＜1.0 μg/kg，低于試劑盒檢出限。國(guó)家對(duì)發(fā)酵食品中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)是5 μg/kg［13］。結(jié)果表明樣品中的黃曲霉毒素B1遠(yuǎn)低于此標(biāo)準(zhǔn)，尤其是基酒和成品酒中幾乎不存在黃曲霉毒素B1。

2.3.2赭曲霉毒素A的含量

用酶標(biāo)儀對(duì)處理后各個(gè)樣品的OD值進(jìn)行測(cè)定，獲得的OD值數(shù)據(jù)用該劑盒提供的RIDAWIN軟件分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同樣品的赭曲霉毒素A含量Fig.3 Contents of ochratoxin A in different samples

由圖3可知，所測(cè)定的赭曲霉毒素A在大曲中的含量分別為1.6 μg/kg和1.4 μg/kg，入窖酒醅中分別為1.7 μg/kg和1.6 μg/kg，丟糟中分別為1.9 μg/kg和1.7 μg/kg，黃水中分別為2.1μg/kg和2.0μg/kg，基酒和成品酒樣中的赭曲霉毒素A含量＜0.3μg/kg，都遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)外食品行業(yè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3桔霉素的含量

對(duì)處理后的濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中各個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出含有桔霉素，含量都低于該酶聯(lián)免疫試劑盒的最低檢出限，也從一個(gè)側(cè)面反映出了桔霉素在濃香型白酒的釀酒工業(yè)上是安全的。

2.4精密度檢測(cè)

分別對(duì)工作濃度C3（0.300 μg/kg）、C4（0.900 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)品與稀釋3倍的大曲1、黃水1測(cè)定5次，所得結(jié)果如表2、表3所示。

表2　黃曲霉毒素B1測(cè)定的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision experiment results of aflatoxins B1

表3　赭曲霉毒素A測(cè)定的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision experiment results of ochratoxin A

由表2和表3可知：黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.239%～3.388%和1.052%～3.368%，精密度較好，說(shuō)明該測(cè)定方法可應(yīng)用于白酒釀造環(huán)節(jié)各樣品中黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的定量分析。

2.5回收率試驗(yàn)

選取真菌毒素含量較高的黃水1作為試驗(yàn)樣品，分別向樣品中準(zhǔn)確添加質(zhì)量濃度為0.3 μg/kg、0.9 μg/kg、2.7 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3次，按照測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如表4、表5所示。

表4　黃曲霉毒素B1測(cè)定的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery rates experiment results of aflatoxins B1

表5　赭曲霉毒素A測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Recovery rates experiment results of ochratoxin A

由表4和表5可知，黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A樣品加標(biāo)測(cè)定的回收率分別為95.1%～97.8%和95.4%～98.4%，平均回收率分別為96.2%和96.4%，說(shuō)明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度較好。

3　結(jié)論

酶聯(lián)免疫法是一種利用抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)，考慮到目前國(guó)內(nèi)大多是白酒廠地處偏僻，檢測(cè)條件較差，相關(guān)技術(shù)人員較少，商品化的真菌毒素檢測(cè)試劑盒，具有特異性高、簡(jiǎn)便快速、污染小、不需要昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)［14］，特別適合于各大中小型酒廠對(duì)白酒原料、產(chǎn)品和副產(chǎn)物的檢驗(yàn)，同時(shí)有利于運(yùn)用白酒庫(kù)存原料和大曲中真菌毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢工作。

白酒業(yè)是我國(guó)的傳統(tǒng)行業(yè)，歷史悠久，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展發(fā)揮著十分重要的作用。因此，保證占據(jù)著我國(guó)白酒市場(chǎng)主導(dǎo)位置的濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程的安全性就顯得很有必要［15-16］。本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)了來(lái)自瀘州老窖白酒釀造過(guò)程中各種樣品3種真菌毒素的含量，結(jié)果表明，3種真菌毒素在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的含量都在國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)［17-18］，同時(shí)利用精密度檢測(cè)試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)說(shuō)明該方法可以運(yùn)用于白酒生產(chǎn)過(guò)程中的真菌毒素的檢測(cè)。易于普及推廣為白酒行業(yè)的安全性驗(yàn)證，為釀酒工業(yè)的長(zhǎng)盛不衰奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Safety testing of mycotoxins in Luzhou-flavor liquor production

LI Mi1，DENG Jie1，YANG Yuehuan1，WEI Chunhui1*，HUANG Zhiguo1，LUO Huibo1，YE Guangbin1，YANG Xiaodong2，HUANG Zhiyu3
（1.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Industrial Park Management Committee of Jiang'an County，Jiang'an 644200，China；3.Wine Institute of Sichuan Province，Guanghan 610000，China）

The content of related mycotoxins in Luzhou-flavor liquor samples（Daqu，fermented grains，distiller's grains，yellow water，base liquor，final product）was detected with ELISA.The results showed that the content of aflatoxins B1in Daqu，fermented grains，distiller's grains and yellow water was 2.55 μg/kg，1.75 μg/kg，1.95 μg/kg and 2.25 μg/kg，respectively；the content of ochratoxin A in Daqu，fermented grains，distiller's grains，yellow water was 1.50 μg/kg，1.65 μg/kg，1.80 μg/kg and 2.05 μg/kg，respectively.Aflatoxins B1and ochratoxin A were not detected in both base liquor and final product，while citrinin was not detected in six kinds of samples.These three kinds of mycotoxins in samples all met the National Standards of fermented food.Moreover，precision and recovery experiments demonstrated that ELISA presented good stability to apply to quantitative analysis of samples from production process of Chinese liquor.

ELISA；mycotoxin；Luzhou-flavor liquor；safety

TS262.31

A

0254-5071（2015）10-0129-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.029

2015-09-18

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（NJ2011-10，NJ2014-16）；自貢市科技項(xiàng)目（2013X07，2014ZC03）

李覓（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸粕锛夹g(shù)。

衛(wèi)春會(huì)（1980-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。