盧福芝，李啟虔，劉王輝，周婷婷，李羅春，李靜蘭

(河池學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 宜州 546300)

鎘是一種比較稀有的元素，應(yīng)用較為廣泛，常用于生產(chǎn)鎘電池、塑料、顏料和試劑等[1]。但是，鎘也是一種對人體和動物危害極大的元素，已被列入美國環(huán)保署水環(huán)境中優(yōu)先污物、空氣中重點控制的有害污染物名單及我國有毒化學(xué)品的優(yōu)先登記名單[2]。環(huán)境中鎘的自然來源很少，但隨著采礦、冶煉等工業(yè)的發(fā)展，越來越多的鎘被排放出來。據(jù)調(diào)查顯示，在礦區(qū)及冶煉廠附近的環(huán)境中檢測到的鎘濃度比其他地區(qū)要高得多[3]。在污染地區(qū)鎘中毒的事件常有發(fā)生，鎘對人體的毒害引起了世界各國的重視。

目前，科學(xué)家們對由鎘等重金屬造成環(huán)境污染的修復(fù)研究正如火如荼地進(jìn)行，其中以生物修復(fù)技術(shù)中利用微生物進(jìn)行重金屬污染修復(fù)是研究的熱點[4－5]。Hassan SW(2012)，鄭曉丹(2010)，Zhang J.(2010)，Al－Garni S(2009)，Hassan SW(2009)研究表明微生物對重金屬具有較好的吸附性，在重金屬污染修復(fù)中將發(fā)揮重要的作用[6－10]。本研究以實驗室保藏的抗鎘淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4為出發(fā)菌株，研究培養(yǎng)溫度，初始pH，不同Cd2+濃度對其生長的影響以及不同Cd2+濃度生長中pH及吸附率的影響，為該菌應(yīng)用于重金屬污染修復(fù)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

實驗室保藏的抗鎘菌株:淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4，抗Cd2+濃度為268 mmol/L。

1.2 培養(yǎng)基

YPG培養(yǎng)基(L):蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，固體培養(yǎng)基時加入瓊脂粉15 g，去離子水定容至1000 mL，pH自然，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

將活化后的菌株LLC4接種到Y(jié)PG培養(yǎng)基固體平板上，同時將其分別放入溫度為25℃、28℃、32℃、35℃、38℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察菌落的生長情況，并用游標(biāo)卡尺測量菌落的直徑。

1.4 不同初始pH對菌株生長的影響

配制pH為5、6、7、8、9、10的YPG固體培養(yǎng)基，將活化后的菌株LLC4分別接種到不同pH的YPG培養(yǎng)基固體平板上，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況，并用游標(biāo)卡尺測量菌落的直徑。

1.5 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

將活化好的菌株LLC4接入YPG液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm培養(yǎng)3 d后收集濕菌體。分別稱取1 g濕菌體接入含0 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L Cd2+的100 mL YPG液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm培養(yǎng)，每隔8 h取樣，抽濾收集培養(yǎng)液中的菌體，將菌體置于35℃干燥箱中進(jìn)行干燥后稱量干菌體的重量，記錄菌株從接種始至7 d內(nèi)干菌體的量。

1.6 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響

按照1.5的方法將菌株LLC4接入含不同Cd2+濃度的YPG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期取樣測定培養(yǎng)液中的pH，檢測不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響。

1.7 菌株對Cd2+吸附率的測定

1.7.1 原子吸收法測鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將1000 μg/mL的鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至10 μg/mL，取6個250 mL的容量瓶，用1% 的優(yōu)級純硝酸溶液將10 μg/mL的鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L，用1%的硝酸作為空白對照。用原子火焰吸收法直接測定鎘標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 鎘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上述方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.99758，曲線方程:Y=0.1651*X+0.0032，具有很好的線性關(guān)系。

1.7.2 活菌體對Cd2+吸附率的測定

將活化后的菌株LLC4濕菌體1 g接種至不含Cd2+的YPG液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm培養(yǎng)2 d，使菌體達(dá)到一定濃度后加入 Cd(NO3)2溶液，使培養(yǎng)液中 Cd2+的終濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L，以不加菌體僅加入相應(yīng)濃度Cd2+的培養(yǎng)基為空白對照。加入Cd2+后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 d后離心，用火焰原子吸收法測定上清液中Cd2+的濃度(空白對照中Cd2+的濃度用C0表示，加入菌體上清液中Cd2+的濃度用C1表示)，檢測菌株對Cd2+的吸附率[11]。

1.7.3 失活菌體對Cd2+吸附力的測定

為了檢測失活菌體對Cd2+的吸附作用，將活化后的菌株LLC4濕菌體1 g接種至不含Cd2+的YPG液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm培養(yǎng)2 d后，將培養(yǎng)液進(jìn)行濕熱滅菌滅活其中的菌體，而后向滅菌培養(yǎng)液中加入Cd(NO3)2溶液，使培養(yǎng)液中Cd2+的終濃度為10 mmol/L，按1.7.2的方法測定菌株的吸附率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

菌株LLC4置于不同溫度中培養(yǎng)3 d后，用游標(biāo)卡尺測定菌落的直徑大小，每個溫度的菌落直徑均取平均值，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溫度培養(yǎng)下菌株的菌落直徑

由表1可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株LLC4的菌落直徑先由小變大，然后再變小，且變化較為明顯，說明培養(yǎng)溫度對其生長影響較大。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，菌落直徑最大，達(dá)17 mm，說明在此溫度下菌落生長最好。由此可知，菌株LLC4的最適培養(yǎng)溫度為28℃。

2.2 不同初始pH對菌株生長的影響

菌株LLC4置于不同pH中培養(yǎng)3 d后，用游標(biāo)卡尺測定菌落的直徑大小，每個pH的菌落直徑均取平均值，結(jié)果如表2所示。

表2 不同初始pH培養(yǎng)下菌株的菌落直徑

由表2可知，隨著初始培養(yǎng)pH的升高，菌株LLC4的菌落直徑先由小變大，然后再變小，但變化不大。這說明菌株LLC4有較廣的pH適應(yīng)范圍，培養(yǎng)初始pH對其生長影響不明顯。由于用于培養(yǎng)菌株LLC4的YPG培養(yǎng)基天然pH在5.5左右，因此為了培養(yǎng)及研究方便，均使用pH天然的YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株。

2.3 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

將活化好的菌株LLC4 1 g濕菌體接入YPG液體培養(yǎng)基后，每隔8 h取樣用抽濾機收集濕菌體后干燥至恒重稱取其干菌體質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可看出，在初期，不同Cd2+濃度培養(yǎng)干菌體的質(zhì)量都呈快速上升趨勢。含Cd2+0 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重在80～88 h達(dá)最大值0.99 g，含Cd2+10 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重在88～112 h達(dá)到最大值1.32 g，含Cd2+20 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重在96～112 h均達(dá)到最大值0.95 g。隨著培養(yǎng)時間的延長，由于菌體老化自溶，在三種Cd2+濃度中培養(yǎng)的菌體干重均呈現(xiàn)不同的下降趨勢，但在含Cd2+0 mmol/L、10 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重下降較快，在含Cd2+20 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重后期緩慢下降，這是由于菌株在高濃度Cd2+中生長受到一定抑制，使得其生長周期延長。從整個培養(yǎng)過程看，在含Cd2+10 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體干重明顯比另外兩個Cd2+濃度中培養(yǎng)的菌體干重要大，說明低濃度的Cd2+對菌株LLC4的生長有促進(jìn)作用，而在含Cd2+20 mmol/L的培養(yǎng)基中比在0 mmol/L中培養(yǎng)的菌體干重整體要小些，說明高濃度的Cd2+會抑制菌株LLC4的生長。

2.4 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH的影響

將活化好的菌株LLC4 1 g濕菌體接入YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)后，每隔8 h取樣測定培養(yǎng)液中的pH，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在培養(yǎng)過程中不同Cd2+濃度中培養(yǎng)液pH均呈先下降后快速上升趨勢，而后又稍有下降。菌株在含Cd2+0 mmol/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)液的pH在0～40 h處于下降趨勢，而后上升，在152 h達(dá)最大值9.11;在含Cd2+10 mmol/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)液的pH在0～32 h處于下降趨勢，而后上升，在160 h達(dá)最大值8.91;在含Cd2+20 mmol/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)液的pH在0～24 h處于下降趨勢，而后上升，在120 h達(dá)最大值7.13。菌株在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液pH發(fā)生變化是由于其生長過程中代謝發(fā)生變化，pH下降可能是代謝中產(chǎn)生有機酸類的中間代謝物，pH上升可能是發(fā)生了轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生堿性的代謝產(chǎn)物。在整個培養(yǎng)過程中，由圖3明顯看出隨著Cd2+濃度的升高，培養(yǎng)液中的pH先下降后上升的趨勢要快，但整個過程pH的變化幅度變小，說明培養(yǎng)基中Cd2+濃度的高低對菌株LLC4的代謝活動有較為重要的影響。

圖2 不同Cd2+濃度對菌株生長量的影響

圖3 不同Cd2+濃度對菌株生長中pH 的影響

2.5 菌株對Cd2+吸附率的測定

按照1.7.2和1.7.3的方法分別測定菌株LLC4的活菌體和失活菌體對Cd2+的吸附率，其測定結(jié)果如表3所示。

表3 菌株對Cd2+的吸附率

由表3可知，活菌體在初始Cd2+濃度為5 mmol/L的培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm進(jìn)行吸附實驗，48 h后吸附率達(dá)65.17%。隨著培養(yǎng)基中初始Cd2+濃度增加，菌體的吸附率降低。這是因為菌體細(xì)胞對重金屬的吸附量是有限的，菌體吸附量到達(dá)一定程度后吸附速度會降低，達(dá)到飽和后將不在吸附甚至有可能會將重金屬解吸出來。此外，過高的Cd2+濃度會影響菌體的生長繁殖從而導(dǎo)致吸附率降低。表3中顯示失活的菌體對Cd2+的吸附率為3.10%，說明將菌體進(jìn)行滅活處理后仍可吸附一定Cd2+，但吸附率遠(yuǎn)比活菌體的低，這結(jié)果與 Tangaromsuk[12]和曾曉希[13]等的研究結(jié)果一致。

3 總結(jié)與展望

3.1 總結(jié)

以實驗室保藏的一株抗鎘淡紫擬青霉菌(Paecilomyces lilacinus)LLC4為出發(fā)菌株，經(jīng)研究得出菌株LLC4最適培養(yǎng)溫度和初始pH分別為28℃和8;低濃度Cd2+對菌株LLC4的生長有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)初始培養(yǎng)Cd2+濃度為10 mmol/L時，其有較好生長量;Cd2+會影響菌株LLC4的代謝活動進(jìn)而使培養(yǎng)液中pH發(fā)生變化，Cd2+濃度越高，整個培養(yǎng)過程培養(yǎng)液中pH變化范圍越小;菌株LLC4對Cd2+的吸附率隨Cd2+濃度的增加而降低，在初始Cd2+為5 mmol/L時，培養(yǎng)48 h后對Cd2+的吸附率最大，達(dá)65.17%。

3.2 展望

處于礦區(qū)中的微生物，由于長期受到環(huán)境中重金屬的脅迫，往往會對重金屬產(chǎn)生一定的抗性作用，有些微生物甚至可以將重金屬吸附進(jìn)體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化以降低其毒害作用。因此可從礦區(qū)中篩選出對重金屬有較強抗性的微生物，研究抗性菌株的生長及吸附活化重金屬特性，為利用微生物修復(fù)重金屬污染提高理論研究基礎(chǔ)。本論文的研究內(nèi)容還屬于初始的基礎(chǔ)階段，今后可往以下幾個方面進(jìn)行深入的研究:

(1)研究菌株LLC4吸附水中鎘的最佳條件，如吸附時的溫度、pH、轉(zhuǎn)速、菌體量等;

(2)檢測菌株LLC4對混合重金屬的耐受性及同時吸附多種重金屬的條件;

(3)開展菌株LLC4對土壤中重金屬的吸附研究，并可結(jié)合植物進(jìn)行聯(lián)合吸附實驗。

[1]劉麗.耐Cu、Cd微生物的分離篩選及其吸附機理研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué)，2010.

[2]隆美容，謝小林，馮廣達(dá)，等.鉛鋅尾礦中耐重金屬鎘的絲狀真菌的分離鑒定[J].微生物學(xué)通報，2013，40(12):2203－2216.

[3]Brookes P C.Mcgrath S P.Effect of metal toxicity on the size of the soil microbial biomass[J].J.Soil Sei，1984，35:341.

[4]金忠民，郝宇，劉麗杰，等.一株鉛鎘抗性菌株的分離鑒定及其生物學(xué)特性[J].環(huán)境工程學(xué)報，2015(7):3551－3557.

[5]R N N Abskharon，S H A Hassan，S M F Gad EI－ Rab，et al.Heavy metal resistant of E.coli isolated from wastewater in sites in assiut city，E-gypt[J].Bull Environ Contam Toxiclol，2008，81:309 － 315.

[6]Hassan SW，El－ Kassas HY.Biosorption of cadmium from aqueous solutions using a local fungus Aspergillus cristatus(glaucus group)[J].African Journal of Biotechnology，2012，11(9):2276 －2286.

[7]鄭曉丹.變形假單胞菌吸附鎘的機制及其吸附條件的研究[D].福州:福建師范大學(xué)，2010.

[8]Zhang J，Min H.Characterization of a multimetal resistant Burkholderia fungorum isolated from an e－waste recycling area for its potential in Cd sequestration[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26(2):371 －374.

[9]Al－ Garni S，Ghanem K，Bahobail A.Biosorption characteristics of Aspergillus fumigatus in removal of cadmium from an aqueous solution[J].African Journal of Biotechnology，2009，8(17):4163 －4172.

[10]Hasan SH，Bhattacharjee BN，et al..Biosorption of Cd(Ⅱ)from Water Using Citrobacter koseri[J].IFMBE Proceedings，2008，21(4):833 －837.

[11]奚旦立，孫裕生.環(huán)境監(jiān)測(第4版)[M].北京:高等教育出版社，2010.

[12]Tangaromsuk J，Pokethitiyook P，Knlatrachue M，et al.Cadmium biosorption by Sphingomonas paueimobilis biomass[J].Biore － source Teehnology，2002，85:103 －105.

[13]曾曉希.抗重金屬微生物的篩選及其抗鎘機理和鎘吸附特性研究[D].長沙:中南大學(xué)，2010.