李俊，朱欣果,，萬洪深，王琴，唐宗祥，符書蘭，楊足君，楊漫宇，楊武云

1.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，成都 610066；

2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川農(nóng)業(yè)大學植物遺傳育種省級重點實驗室，溫江 611130；

3.電子科技大學生命科學與技術(shù)學院，成都 610054

1RS-7DS.7DL小麥-黑麥小片段易位系的鑒定

李俊1，朱欣果1,2，萬洪深1，王琴1，唐宗祥2，符書蘭2，楊足君3，楊漫宇1，楊武云1

1.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，成都 610066；

2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川農(nóng)業(yè)大學植物遺傳育種省級重點實驗室，溫江 611130；

3.電子科技大學生命科學與技術(shù)學院，成都 610054

黑麥(Secale cereale L.,RR)是改良普通小麥(Triticum aestivum L.,AABBDD)的重要基因資源，將黑麥優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中，是小麥品種改良的有效途經(jīng)之一。文章將四川地方品種蓬安白麥子(T.aestivum L., AABBDD)與秦嶺黑麥(S.cereale cv.Qinling,RR)雜交，染色體自動加倍獲得八倍體小黑麥CD-13(AABBDDRR)；通過順序FISH和GISH分析，發(fā)現(xiàn)該八倍體小黑麥1RS端部與7DS的端部發(fā)生相互易位，是一個攜帶1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位染色體的八倍體小黑麥。利用八倍體小黑麥CD-13與四川推廣小麥品種川麥42雜交、連續(xù)自交，獲得包含60個株系的F5群體；對F5群體的58個株系進行GISH和FISH分析發(fā)現(xiàn)，其中13個株系含有1RS-7DS.7DL小片段易位染色體。在這13個株系中，株系811染色體數(shù)目為2n=6x=42，是穩(wěn)定的1RS-7DS.7DL小片段易位系；并且1RS特異分子標記和醇溶蛋白分析表明，1RS-7DS.7DL易位染色體1RS小片段的斷裂點位于分子標記IB267-IAG95之間，不包含編碼黑麥堿蛋白的Sec-1位點；同時1RS-7DS.7DL小片段易位系的千粒重與川麥42相當，遠遠高于八倍體小黑麥CD-13，對千粒重無負作用。因此，1RS-7DS.7DL小麥-黑麥小片段易位系可作為進一步深入研究1RS小片段上的優(yōu)異基因及其遺傳效應(yīng)的重要材料。

小麥；黑麥；1RS-7DS.7DL；小片段易位

黑麥(Secale cereale L.,2n=2x=14,RR)攜帶大量抗病、抗逆、高產(chǎn)等優(yōu)良基因[1~6]，是普通小麥(Triticum aestivum L.,2n=6x=42,AABBDD)遺傳改良的重要基因資源。通過小麥–黑麥遠緣雜交，一些黑麥的染色體或染色體片段已被導(dǎo)入普通小麥，特別是黑麥1R染色體短臂(1RS)的導(dǎo)入，為普通小麥的改良做出了巨大貢獻[7~13]。黑麥1RS攜帶抗蟲、抗條銹病、葉銹病、稈銹病、白粉病以及提高產(chǎn)量和環(huán)境適應(yīng)性的基因[14~21]，過去幾十年來一直被育種家廣泛應(yīng)用。截至目前，鑒定出的小麥–黑麥易位系超過16個[8,22,23]，其中，常用的小麥–黑麥易位系主要是1RS.1AL、1RS.1BL、1RS.1DL[9,15,20,23~25]，其中利用1RS.1BL易位系育成的高產(chǎn)、抗病的推廣品種最多[9,26]。

然而，由于1RS.1BL易位系白粉病、條銹病抗性的逐漸喪失，及其Sec-1(黑麥堿)基因會顯著降低小麥品質(zhì)[27,28]，從而限制了1RS導(dǎo)入系在小麥改良中的應(yīng)用。近年來，研究者已利用不同來源的1RS創(chuàng)制了新的抗病易位系，一定程度上解決了抗病性喪失的問題[29,30]；通過各種手段，也獲得了一批黑麥堿基因缺失的小麥–1RS易位系。Lukaszewski[31,32]和Anugrahwati等[33]通過各種1RS.1BL易位系間部分同源重組和遺傳操作，獲得了黑麥堿基因缺失的1RS-1BS.1BL小片段改良重組體；Masoudi-Nejad等[34]利用殺配子系統(tǒng)成功將小片段1RS易位到小麥2A、2D、3D、5D和7D染色體，并產(chǎn)生了Sec-1位點缺失的1RS-5DL.5DS、1RS-3DL.3DS和1RS-7DS.7DL小麥–黑麥非部分同源小片段易位染色體，其1RS小片段來源于黑麥Imperial。目前，由于受遺傳補償效應(yīng)的影響，育種應(yīng)用效果較好的小麥–黑麥易位通常發(fā)生在部分同源群間，而非部分同源易位在小麥育種上應(yīng)用的相關(guān)報道很少。

本研究利用四川地方品種蓬安白麥子(T. aestivum L.,AABBDD)與秦嶺黑麥(S.cereale cv. Qinling,RR)雜交、染色體自動加倍獲得1份八倍體小黑麥CD-13(AABBDDRR)。通過順序熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和基因組原位雜交(Genomic in situ hybridization,GISH)分析，發(fā)現(xiàn)該八倍體小黑麥1RS端部與7DS的端部發(fā)生相互易位，產(chǎn)生了1RS-7DS.7DL小麥–黑麥非部分同源小片段易位染色體。本研究利用八倍體小黑麥CD-13與四川推廣品種川麥 42雜交并自交，將1RS-7DS小麥–黑麥小片段易位成功轉(zhuǎn)入到小麥品種川麥42中。利用GISH、FISH技術(shù)和分子標記技術(shù)鑒定CD-13/川麥42 F5群體中的1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位染色體，通過對 F5中含有1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位染色體株系千粒重的分析，初步探討該非部分同源小片段易位對千粒重的影響，為進一步利用1RS-7DS.7DL易位染色體進行普通小麥遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

八倍體小黑麥CD-13是1993-1995年由蓬安白麥子與秦嶺黑麥雜交，自動加倍和結(jié)實后獲得。本研究以八倍體小黑麥CD-13為母本，川麥42為父本，雜交后再連續(xù)自交至F5代，獲得包括60個株系的F5群體；對其中58個發(fā)芽正常的株系(每個系10粒種子)分別進行GISH和FISH分析。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交

采用GISH和FISH的方法對所有材料的根尖細胞中期染色體進行分析鑒定。根尖細胞中期染色體的制備、探針標記方法和原位雜交程序按照Han等[35]描述的方法。GISH分析中，用秦嶺黑麥基因組DNA作探針。此外，用重復(fù)序列pTa-535[36]和pSc119.2[37]為探針進行FISH分析。八倍體小黑麥CD-13采用順序FISH和GISH分析方法，先進行FISH，褪色后再進行GISH。

1.2.2 1RS染色體分子標記分析

采用CTAB方法，提取八倍體小黑麥CD-13、蓬安白麥子、秦嶺黑麥、川麥42及F5代的58個株系的幼嫩葉片DNA。利用黑麥1RS特異分子標記及編碼黑麥堿的Sec-1位點的標記SEC-1和SEC-1b[38~42]，檢測攜帶1RS染色體臂或片段的株系及其親本八倍體小黑麥CD-13和川麥42，分析1RS-7DS.7DL中小片段易位的斷裂點。分子標記由寶生物公司(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd)合成，標記序列見表1。黑麥1RS特異分子標記的PCR反應(yīng)體系及程序參照Lei等[38]的方法，特異標記SEC-1和SEC-1b的PCR反應(yīng)體系及程序分別參照Masoudi-Nejad[34]和張立平等[41]的方法。

1.2.3 醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)分析

采用1986年ISTA頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(pH3.2)標準程序檢測供試材料的黑麥堿蛋白，在此基礎(chǔ)上凝膠溶液和染色液的比例略有改動。凝膠溶液配置比例為：10%的丙烯酰胺，0.4%的亞甲基丙烯酰胺，6%的尿素，0.1%抗壞血酸和0.004%硫酸亞鐵；染色液配置比例為：10%的三氯乙酸和4%考馬斯亮藍R-250。

表1 黑麥1RS染色體上的特異分子標記

1.2.4 千粒重測定

2012、2013兩年在成都種植CD-13/川麥42群體及其親本CD-13、川麥42、蓬安白麥子、秦嶺黑麥。按照隨機區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)，每個株系種植1行，行長1.5 cm，行距20 cm，采用免耕、條溝點播、細土蓋種栽培方式。通過定苗使不同株系的基本苗數(shù)一致，播前和苗期進行化學除草，中后期施藥防治蚜蟲，收獲后測千粒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 八倍體小黑麥CD-13中的小片段易位鑒定

圖1 八倍體小黑麥CD-13根尖中期細胞的FISH(A)和GISH(B)分析A：以pTa-535(紅)和pSc119.2(綠)為探針進行FISH分析；B：以秦嶺黑麥基因組DNA(紅)為探針進行GISH分析。短箭頭所指為1RS-7DS.7DL易位染色體，長箭頭所指為7DS-1RS.1RL易位染色體。

采用順序FISH(圖1A)和GISH(圖1B)的方法分析八倍體小黑麥CD-13，以pTa-535[36]和pSc119.2[37]為探針進行FISH分析；以秦嶺黑麥基因組DNA為探針，中國春基因組DNA為封阻進行GISH分析。結(jié)果表明，八倍體小黑麥CD-13染色體數(shù)目為56，包括42條小麥染色體和14條黑麥染色體(圖1)；其中，2對染色體發(fā)生小麥–黑麥染色體易位。八倍體小黑麥CD-13中的1RS端部與7DS的端部位置發(fā)生相互易位，即7D染色體上7DS端部與1RS端部易位(1RS-7DS.7DL)，1R染色體上1RS端部與7DS端部易位(7DS-1RS.1RL)(圖1)。

2.2 小片段易位的遺傳轉(zhuǎn)育

選取八倍體小黑麥CD-13與川麥42雜交F5代群體中的58個發(fā)芽正常的株系用于GISH和FISH分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個株系含有黑麥染色質(zhì)(表2)，所占比例為37.9%；其中，10個株系染色體數(shù)目為42，1個株系染色體數(shù)目為41，4個株系染色體數(shù)目為43，6個株系染色體數(shù)目為44，1個株系染色體數(shù)目為45。

含有黑麥染色質(zhì)的22個株系中，7個株系含有整條黑麥染色體，2個株系含有1對1RS.wheat?(未知小麥染色體)易位染色體，13個株系含有1RS-7DS.7DL易位染色體，所占比例分別為12.07%、3.45%、22.41%。含有整條黑麥染色體的7個株系中，1個株系含有1對4R染色體，1個株系含有1對6R染色體，1個株系含有1條6R染色體，1個株系含有1對7R染色體，1個株系含有1對4R染色體和1條7R染色體，1個株系含有1條1RL染色體臂和1條7R染色體，1個株系含有1條未知黑麥染色體。對于7個含有黑麥整條染色體和2個含有1RS.wheat?染色體的株系將進一步鑒定后再做詳細分析。

表2 八倍體小黑麥CD-13/川麥42 F5群體中含有黑麥染色質(zhì)的株系

含有1RS-7DS.7DL易位染色體的13個株系中，6個株系含有 1對 1RS-7DS.7DL染色體和 1對7DS-1RS.1RL染色體(圖2A)；1個株系含有1對1RS-7DS.7DL染色體(圖2B)；2個株系僅含有1條1RS-7DS.7DL染色體(圖2C和2D)；1個株系含有1對1RS-7DS.7DL染色體和1條7DS-1RS.1RL染色體；1個株系含有1條1RS-7DS.7DL染色體和1對 7DS-1RS.1RL染色體；1個株系含有 1條1RS-7DS.7DL染色體和1條7DS-1RS.1RL染色體；1個株系含有 1條 1RS-7DS.7DL染色體和 1條1RS.wheat?易位染色體。以上攜帶1RS-7DS.7DL小片段易位染色體的株系中，3個株系僅含1RS-7DS.7DL易位染色體，其中765(圖2C)和799(圖2D)株系染色體數(shù)目為42，含1條1RS-7DS.7DL易位染色體；編號為811的株系染色體數(shù)目為42(圖2B)，含1對1RS-7DS.7DL易位染色體，是純合的1RS-7DS.7DL易位系。由此表明，八倍體小黑麥CD-13攜帶的1RS-DS.7DL小片段易位染色體被成功轉(zhuǎn)入六倍體普通小麥中，并且能夠穩(wěn)定遺傳。

2.3 1RS-7DS.7DL易位染色體中1RS斷裂點分析

利用A-PAGE對CD-13/川麥42 F5群體中含有1RS染色體臂或片段的15個株系及親本進行醇溶蛋白分析，發(fā)現(xiàn)F5群體中765、799和811株系及親本蓬安白麥子、川麥42不含ω區(qū)域的黑麥堿蛋白的3條帶，秦嶺黑麥、CD-13及其他12個株系均含有黑麥堿蛋白的3條帶(圖3，表3)。由此表明，765、799和811株系黑麥堿蛋白缺失。

圖2 八倍體小黑麥CD-13/川麥42 F5代中的染色體易位以秦嶺黑麥基因組DNA(紅)、pTa-535(紅)和pSc119.2(綠)為探針進行原位雜交，染色體用DAPI染色(藍)。箭頭示易位染色體，短箭頭所指為1RS-7DS.7DL，長箭頭所指為7DS-1RS.1RL。A：株系769，2n=42，含1對1RS-7DS.7DL和1對7DS-1RS.1RL易位染色體；B：株系811，2n=42，含1對1RS-7DS.7DL易位染色體；C：株系765，2n=42，含1條1RS-7DS.7DL易位染色體；D：株系799，2n=42，含1條1RS-7DS.7DL易位染色體。

圖3 CD-13/川麥42 F5群體中部分株系及親本的醇溶蛋白A-PAGE分析1：蓬安白麥子；2：秦嶺黑麥；3：CD-13；4：川麥42。

進一步利用黑麥1RS染色體上的特異分子標記及編碼黑麥堿的Sec-1位點的特異標記，對含有1RS染色體臂或片段的15個株系及親本進行基因型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對分子標記IB267，15個系均有250 bp條帶，蓬安白麥子和川麥42則無擴增產(chǎn)物(圖4，表3)；編碼黑麥堿的Sec-1位點的SEC-1和SEC-1b標記以及IAG95等9個分子標記，僅765、799和811及親本蓬安白麥子、川麥42無擴增帶，其他12個系和親本秦嶺黑麥、八倍體小黑麥CD-13均有擴增帶(圖4，表3)。由此表明，765、799和811與蓬安白麥子和川麥42一樣，編碼黑麥堿蛋白的Sec-1位點缺失，且1RS-7DS.7DL染色體中小片段易位的斷裂點在1RS染色體端部標記IB267-IAG95之間(圖5)。

2.4 小片段易位對千粒重的影響

2012、2013兩年千粒重分析發(fā)現(xiàn)，CD-13、秦嶺黑麥和蓬安白麥子千粒重較低，分別為23.2 g、23.9 g、27.3 g，川麥42千粒重較高，為48.0 g；13個攜帶1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位染色體的株系平均千粒重變幅在37.0-51.5之間(表4)，均高于CD-13。含有1對1RS-7DS.7DL染色體的純合易位系811平均千粒重為47.8 g，遠遠高于CD-13，與川麥42千粒重差異不顯著；僅含有1條1RS-7DS.7DL染色體的2個株系765和799平均千粒重分別為48.3 g、51.5 g，比川麥42分別增加0.3 g、3.5 g；而既含有1RS-7DS.7DL染色體，又含有7DS-1RS.1RL染色體的株系千粒重普遍較低(表4)。由此表明，1RS-7DS小麥–黑麥非部分同源小片段易位對千粒重無負作用。

表3 含有1RS染色體片段的15個株系及其親本的DNA標記和SEC1蛋白檢測

圖4 CD-13/川麥42 F5群體中部分株系1RS染色體及編碼黑麥堿Sec-1位點的特異標記PCR擴增產(chǎn)物分析1：蓬安白麥子；2：秦嶺黑麥；3：CD-13；4：川麥42。

圖5 1RS-7DS.7DL小片段易位染色體在1RS染色體上的斷裂點標記在1RS染色體臂上的位置根據(jù)前人的圖譜[34,38,39]。染色體左邊為標記，右邊箭頭所示為斷裂點的位置。

3 討 論

目前，黑麥的許多抗病、抗逆、高產(chǎn)和廣適等優(yōu)異基因已轉(zhuǎn)移到栽培小麥中，育成的攜帶小麥–黑麥易位的小麥品種已大面積推廣和育種應(yīng)用[7~13]。但是，已鑒定出的小麥–黑麥易位類型中，有關(guān)1RS-7DS易位類型的報道較少。亓增軍等[43,44]利用染色體C帶和FISH技術(shù)鑒定六倍體普通小麥矮孟牛種質(zhì)資源時，發(fā)現(xiàn)矮孟牛II、IV、V、VI型攜帶一種新型的1RS.7DS和1BL.7DL復(fù)雜易位，這種復(fù)雜易位是在普通小麥雜交過程中，1RS.1BL易位染色體與小麥7D染色體發(fā)生相互易位產(chǎn)生的，其1RS來源于黑麥Petkus，易位類型為著絲粒斷裂的易位。Masoudi-Nejad等[34]利用殺配子系統(tǒng)將1RS小片段導(dǎo)入了小麥7D染色體，創(chuàng)制了不含黑麥堿基因的1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位系，其1RS小片段來源于黑麥Imperial。本研究1RS-7DS.7DL易位染色體也不含黑麥堿基因，其斷裂點在1RS染色體臂端部IB267-IAG95標記區(qū)間；該易位染色體中的1RS小片段來源于秦嶺黑麥，與前人創(chuàng)制的1RS-7DS.7DL小麥–黑麥小片段易位系以及我國目前廣泛使用的1RS及1RS.1BL易位系的來源均不同。

表4 含有1RS-7DS.7DL小片段易位染色體株系的千粒重比較

本研究獲得的八倍體小黑麥CD-13結(jié)實率90%以上，育性較好，穗子長，穗粒數(shù)多，但千粒重低；經(jīng)多年白粉病和條銹病鑒定發(fā)現(xiàn)，高抗白粉病、成株期高抗條銹病，其抗病基因的來源與位置正在深入研究。2012和2013年連續(xù)兩年對CD-13/川麥42 F5群體及其親本進行千粒重測定，發(fā)現(xiàn)純合易位系811平均千粒重為47.8 g，遠遠高于CD-13，與川麥42千粒重差異不顯著；僅含有1條1RS-7DS.7DL染色體的2個株系(765和799)平均千粒重比川麥42分別增加0.3 g和3.5 g；而既含有1RS-7DS.7DL染色體，又含7DS-1RS.1RL染色體的株系千粒重普遍較低，可能是受7DS-1RS.1RL染色體的影響。前人研究表明1RS染色體攜帶大量提高產(chǎn)量、產(chǎn)量構(gòu)成因子及環(huán)境適應(yīng)性的基因[15,18]，其端部大約15%的片段也攜帶大量與生根能力和根的形態(tài)學性狀相關(guān)的基因[45]。本研究創(chuàng)制的純合1RS-7DS.7DL易位系(811)中的1RS端部小片段對千粒重無負作用，但其是否也攜帶可提高產(chǎn)量，增加根生物產(chǎn)量等基因，需進一步研究證明。

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(責任編委:夏先春)

Identification of the 1RS-7DS.7DLwheat-rye small segment translocation lines

Jun Li1,Xinguo Zhu1,2,Hongshen Wan1,Qin Wang1,Zongxiang Tang2,Shulan Fu2, Zujun Yang3,Manyu Yang1,Wuyun Yang1

1.Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding in Wheat(Southwest)of Ministry of Agriculture,Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;
2.Key Laboratory of Plant Breeding and Genetics,College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Wenjiang 611130,China;
3.School of Life Science and Technology,University of Electronic Science and Technology of China,Chengdu 610054,China

Rye(Secale cereale L.,RR)is a valuable genetic resource for the improvement of common wheat (Triticum aestivum L.,AABBDD).Transferring alien ryegenesinto wheatby distanthybridization and automatic chromosome doubling is an important and efficient method to boost agronomic traits,disease resistance and widening the gene pool in wheat.In this study,an octoploid triticale CD-13(AABBDDRR)was obtained via automatic chromosome doubling by crossing landrace Penganbaimaizi(T.aestivum L.,AABBDD)and rye“Qinling rye”(S.cereale cv.Qinling,RR).GISH and FISH analyses indicated that CD-13 contained a 1RS-7DS.7DL wheat-rye small segment translocation chromosome.In order to transfer the 1RS-7DS small segment translocation into hexaploid wheat,58 lines of the F5inbred population from the cross CD-13 x Chuanmai 42 were screened for rye chromosome segments by GISH and FISH analyses.The results showed that 13 lines contained the 1RS-7DS.7DL small segment translocation chromosome by reciprocal translocation between 1RS and 7DS.These translocation lines carrying 1RS small rye alien segment were tested for the translocation breakpoints and the presence of a storage protein locus Sec-1.The Sec-1 locus was absent in the line 811,a stable 1RS-7DS.7DL small segment translocation line.The translocation breakpoint of 1RS-7DS.7DL of this line was located in the interval of IB267-IAG95 around the telomere of 1RS chromosome.Thousand-kernel weight of the line 811 was much higher than the parent CD-13,but not significantly different from Chuanmai 42.This indicated that 1RS-7DS.7DL small segment translocation had no negative effect on thousand-kernel weight in the genetic background of Chuanmai 42.The line with 1RS-7DS.7DL translocation chromosomes can be used as a new genetic material for further studies of valuable genes and their genetic effect on 1RS small segment.

wheat;rye;1RS-7DS.7DL;small segment translocation

2014-10-19;

2015-03-06

國家科技支撐計劃項目(編號：2013BAD01B02-7)，四川省科技計劃項目(編號：2011NZ0098-16，2014TD0014)和四川省財政基因工程項目(編號：2011QNJJ-007)資助

李俊，博士，副研究員，研究方向：小麥資源創(chuàng)制與遺傳育種。Tel:028-84504259；E-mail:lijunchd@126.com

朱欣果，碩士，研究方向：作物推廣。E-mail:zhuxingguo5299@126.com

李俊和朱欣果為并列第一作者。

楊武云，博士，研究員，研究方向：小麥遺傳育種。E-mail:yangwuyun@126.com

10.16288/j.yczz.14-358

時間:2015-3-26 10:12:13

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150326.1012.004.html