秦子順 殷麗華 王開娟 劉琪 程文曉 高鵬 孫可墨 鐘梅 余占海

蘭州大學口腔醫(yī)院修復科，蘭州 730000

牙周病是一類發(fā)生在牙周組織的慢性感染性疾病，其治療以實現(xiàn)牙周組織的完全再生，恢復牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質的正常生理功能為最終目標[1]，但是目前牙周組織缺損一直未能得到完全有效的再生。近年來，組織工程技術迅猛發(fā)展，為牙周病的治療帶來了新的希望。牙周組織工程包括生長因子、支架材料及種子細胞[2]。

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是小檗科淫羊藿屬植物，又名仙靈脾，是從淫羊藿莖葉中提取的總黃酮中的有效成分之一。ICA在促進成骨細胞增殖和分化，調節(jié)免疫，甚至抗腫瘤等方面都有重要作用[3]。理想的組織工程支架材料應具備諸多特性，如良好的生物相容性，較佳的生物可降解性，適宜的表面活性，理想的多孔性結構和高孔隙率及生物可塑性等[4]。納米羥磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHAC）支架是一種仿生骨納米尺寸材料，與天然骨在納米結構上相當接近，其孔隙率高達80%～90%，孔徑100～600 μm，6個月可降解80%以上，是較理想的支架材料。已有研究[5]證實，nHAC可促進并加快骨創(chuàng)傷的愈合，且作用較明顯。人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是來源于牙周組織的一類成體干細胞，能在一定條件下分化成為較成熟的成牙骨質細胞和牙周膜成纖維細胞，可在一定程度上促進牙周組織的自我更新，實現(xiàn)牙周組織缺損的再生[6]。本研究旨在探討ICA對hPDLSCs增殖及骨向分化的影響，觀察將ICA代替?zhèn)鹘y(tǒng)生長因子應用于牙周組織工程的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清，Ⅰ型膠原酶，胰蛋白酶，Dispase酶（Gibco公司，美國）；ICA（中國藥品生物制品檢定所，批號：110737—200415）；基質蛋白-1單克隆抗體STOR-1，人CD146-FITC單克隆抗體（Beckmen Coulter公司，美國）；茜素紅，地塞米松，β-甘油磷酸鈉，維生素C，二甲基亞砜；nHAC材料（清華大學材料系研制）。主要儀器：CO2孵箱（Heraeau公司，德國），YJ-875型超靜工作臺（蘇州凈化設備廠）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）（Olympus公司，日本）。

1.2 原代hPDLSCs的培養(yǎng)、分離和鑒定

1.2.1 細胞的分離培養(yǎng) 在蘭州大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科選擇并收集12～18歲因正畸減數(shù)需拔牙患者而拔除的牙周健康的前磨牙，要求牙體無齲壞、無缺損，拔除后4 h內(nèi)送至實驗室。在超凈工作臺內(nèi)，于無菌培養(yǎng)皿中用PBS液反復沖洗牙體3～4遍，然后使用無菌手術刀片，小心刮取根中1/3處的牙周膜，邊刮取邊用PBS液沖洗，使用眼科剪將刮取的組織塊剪至最小。將獲取的牙周膜組織轉移至離心管中，1 000 r·min-1條件下離心2 min；棄上清液，避光條件下分別加入1 mLⅠ型膠原酶和1 mL Dispase酶，37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化40～50 min，每5 min輕輕振蕩離心管1次，至組織消化為棉絮狀；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)液2 mL，重懸細胞，接種于六孔板中，于每孔中加入2 mL的完全培養(yǎng)液，置于5%CO2孵箱中37 ℃下培養(yǎng)，5 d后初次換液，以后每3 d換液1次，待細胞在六孔板中長滿80%時進行細胞傳代。

1.2.2 有限稀釋法克隆純化hPDLSCs 將收集的對數(shù)生長期hPDLSCs培養(yǎng)上清液在1 500 r·min-1下離心10 min，經(jīng)0.22 μm直徑的小濾器過濾后，與培養(yǎng)基以體積比1∶1混合作為適應性培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的第1代細胞，用適應性培養(yǎng)基倍比稀釋，調整細胞密度至每毫升10～15個，吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后標記單個細胞孔，并補液至每孔200 μL，5 d換液，待克隆長至孔底1/3～1/2后胰酶消化，擴大培養(yǎng)。

1.2.3 純化后hPDLSCs的鑒定 取生長良好的克隆化培養(yǎng)的細胞制備細胞爬片；爬片用PBS沖洗3次，每次5 min，滴加0.3%TritonX-100作用15 min，以增加細胞通透性；滴加3%過氧化氫甲醇溶液作用15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；滴加正常山羊血清孵育30 min，以消除非特異性染色。用SABC法染色進行STOR-1和CD146免疫細胞化學染色，以檢測細胞來源及表達情況，置于熒光顯微鏡下觀察；陰性對照組用PBS替代一抗。

1.3 ICA對hPDLSCs作用的體外研究

1.3.1 體外四甲基偶氮唑鹽（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法檢測ICA對hPDLSCs增殖的作用 將生長良好的第3代hPDLSCs經(jīng)胰酶消化后以每毫升2×105個細胞的密度接種于5塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h；待細胞貼壁后棄去上清液，分2組，分別加入含1×10-7mol·L-1ICA和不含ICA的α-MEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每組設6個復孔。培養(yǎng)第1、2、3、4、5天分別取一塊培養(yǎng)板，每孔加入質量濃度5 g·L-1的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加二甲基亞砜150 μL，輕輕振蕩使結晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測定每孔的吸光度A值。取各孔均值，以A570值反映活細胞的數(shù)目。

1.3.2 體外堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）法檢測ICA對hPDLSCs骨向分化的作用 將生長良好的第3代hPDLSCs消化后以每毫升2×103個細胞的密度接種于3塊96孔板，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄去上清液，分為2組，每組6個復孔。2組分別加入含1×10-7mol·L-1ICA和不含ICA的α-MEM礦化誘導液（10%胎牛血清，α-MEM培養(yǎng)液，10 nmol·L-1地塞米松，0.05 mmol·L-1維生素C，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉），繼續(xù)培養(yǎng)；分別于第3、5、7天取1塊培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，吸干；每孔加0.1%TritonX-100 100 μL，4 ℃冰箱內(nèi)過夜；次日于顯微鏡下觀察，無完整的細胞結構后，吹打，每孔吸取50 μL轉移至另一塊96孔板。按試劑盒說明，依次加入緩沖液、基質液、顯色液，立即混勻，于酶聯(lián)免疫檢測儀520 nm處測定各孔ALP活性值，取其均值進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 體外逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測ICA對hPDLSCs成骨基因的表達情況 將生長良好的第3代hPDLSCs消化后以每毫升2×103個細胞的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄去上清液，分為2組，每組6個復孔；分別加入含1×10-7mol·L-1ICA和不含ICA的α-MEM礦化誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d；分別收集加藥組和未加藥組的細胞，提取細胞RNA，逆轉錄cDNA，行聚合酶鏈反應擴增，采用常規(guī)方法檢測Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）、膠原蛋白Ⅰ（collagenⅠ，ColⅠ）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）基因的表達量，以β-actin為內(nèi)參對照。引物設計詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences of RT-PCR

1.3.4 茜素紅染色檢測ICA對hPDLSCs骨量表達的作用 將生長良好的第3代hPDLSCs消化后以每毫升2×105個細胞的密度接種于3塊6孔板，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄去上清液，分為2組，每組3個復孔；分別加含1×10-7mol·L-1ICA和不含ICA的α-MEM礦化誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第14、21、28天取1塊培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，95%乙醇固定10 min，PBS清洗2次，0.1%茜素紅染色，光鏡下觀察。

1.4 hPDLSCs與nHAC結合能力的觀察

將nHAC切割成直徑2～3 mm的顆粒狀材料，消毒滅菌，備用。將hPDLSCs細胞密度調整至每毫升5×105個，接種到nHAC上，負壓抽吸使hPDLSCs懸液充分進入nHAC的多孔間隙中。小心將負載細胞的nHAC移至24孔板中，小心加入2 mL培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每24 h換液1次；培養(yǎng)72 h后，3%戊二醛固定，脫水，真空干燥，噴金鍍膜后行SEM觀察。

1.5 ICA對hPDLSCs作用的體內(nèi)研究

1.5.1 hPDLSCs與nHAC復合 將nHAC切割成直徑2～3 mm的顆粒狀材料，消毒滅菌，備用。將hPDLSCs細胞密度調整至每毫升5×105個，接種到nHAC上，負壓抽吸使hPDLSCs懸液充分進入nHAC的多孔間隙中。小心將負載細胞的nHAC移至24孔板中，分成2組，分別加入含1×10-7mol·L-1ICA和不含ICA的α-MEM礦化誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.5.2 動物實驗模型的準備及組織學觀察 選擇6～8周齡BALB免疫缺陷雌性小鼠6只，質量20～22 g，分兩組，分別將兩組復合材料等量植入小鼠背側肌層，術后飼養(yǎng)30 d，處死實驗動物，取出植入材料，以40 mol·L-1多聚甲醛固定，置于復合脫鈣液中24 h，水洗，脫水，石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)性切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 細胞生長狀況

hPDLSCs原代培養(yǎng)3～7 d后，組織塊周圍開始有細胞爬出，細胞形態(tài)大多為長梭形或不規(guī)則形，有1～2個突起，約14 d開始匯合，呈放射狀、螺旋狀生長（圖1）。約3周后，細胞長滿孔底80%。生長的細胞以1∶2的比例傳代。最初5代的細胞，培養(yǎng)5～7 d即可長滿培養(yǎng)皿，細胞生長活躍，核分裂象多；6～12代細胞，培養(yǎng)10～14 d鋪滿培養(yǎng)皿，細胞增殖穩(wěn)定。

2.2 細胞表面抗原檢測

免疫細胞化學染色顯示，STOR-1和CD146呈陽性表達（圖2），提示培養(yǎng)的細胞為間充質來源并具有干細胞特性。

2.3 MTT法檢測ICA對hPDLSCs增殖的影響

1×10-7mol·L-1ICA作用于hPDLSCs后，分別于第1、2、3、4、5天用MTT法檢測hPDLSCs增殖情況，并與對照組比較，其結果見圖3：第1天，ICA作用不明顯，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第2天ICA的作用開始明顯，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞數(shù)量呈遞增趨勢。經(jīng)檢測，第2天ICA的作用最強，細胞數(shù)增加最多。

圖1 hPDLSCs的生長狀況 光學顯微鏡Fig 1 Growth condition of hPDLSCs optical microscope

圖2 細胞表面抗原檢測 熒光顯微鏡Fig 2 Detection of cell surface antigens fl uorescence microscope

圖3 hPDLSCs增殖情況Fig 3 Proliferation of hPDLSCs

2.4 ALP法檢測ICA對hPDLSCs骨向分化的作用

1×10-7mol·L-1ICA作用于hPDLSCs，分別在培養(yǎng)第3、5、7天檢測ALP活性，結果見圖4：第3、5、7天時實驗組ALP活性較對照組明顯升高（P＜0.05）。在ICA作用下，3～5 d時ALP活性增長幅度最大。

圖4 hPDLSCs的ALP活性Fig 4 The expression of ALP in hPDLSCs

2.5 RT-PCR法檢測ICA對hPDLSCs成骨基因表達的作用

1×10-7mol·L-1的ICA作用于hPDLSCs后培養(yǎng)7 d，采用RT-PCR法檢測4種成骨基因的相對表達量，其結果見圖5：實驗組Runx2、ColⅠ、OPN、OCN的相對表達量較對照組明顯升高（P＜0.05），以ColⅠ的相對表達量最高。

圖5 RT-PCR法檢測hPDLSCs成骨基因的表達Fig 5 RT-PCR for the detection of osteoblastic marker in hPDLSCs

2.6 茜素紅染色法檢測ICA對hPDLSCs骨量表達的影響作用

1×10-7mol·L-1的ICA作用于hPDLSCs后分別培養(yǎng)14、21、28 d，每次檢測均可見明顯的鈣化結節(jié)，14～28 d的結節(jié)量呈增多趨勢（圖6）。由圖6可見，實驗組鈣化結節(jié)的面積明顯大于對照組。

2.7 hPDLSCs與nHAC結合能力的SEM觀察

SEM觀察可見，hPDLSCs在nHAC上貼附牢固，生長旺盛，伸展充分（圖7）。

圖6 鈣化結節(jié)的形成 茜素紅染色 × 100Fig 6 The formation of calci fi ed nodules alizarin red staining × 100

圖7 hPDLSCs在nHAC上的形態(tài)學觀察 SEMFig 7 Morphology of hPDLSCs on nHAC SEM

2.8 ICA對hPDLSCs作用體內(nèi)研究的組織切片觀察

術后30 d，對照組nHAC周圍可見類骨質及少量編織骨（圖8左）；實驗組nHAC周圍出現(xiàn)大量編織骨，骨小梁表面可見覆以不規(guī)則形狀的成骨細胞，網(wǎng)狀骨小梁間可見新生骨組織和血管（圖8右）。

左：對照組；右：實驗組。

3 討論

種子細胞的選擇是牙周組織工程的首要問題。目前用于牙周組織工程的種子細胞有牙周膜干細胞、牙髓基質干細胞、胚胎干細胞和脂肪干細胞等[7]。在這些細胞中，牙周膜干細胞是存在于牙周組織中的一種成體干細胞，具有干細胞特性，具有高增殖能力、自我更新能力以及多向分化能力，在成骨的同時也可以分化形成類似于牙周膜樣組織，被認為是牙周組織工程的首選種子細胞[8]。本實驗將hPDLSCs作為種子細胞。在培養(yǎng)中觀察可見，經(jīng)原代培養(yǎng)3～7 d后，組織塊周圍開始有細胞爬出，約14 d開始匯合，呈放射狀、螺旋狀生長；約3周后細胞長滿孔底80%；傳代培養(yǎng)時，最初5代細胞生長活躍，核分裂象多，6～12代細胞增殖穩(wěn)定。免疫細胞化學染色顯示，STOR-1和CD146呈陽性表達，可見培養(yǎng)的細胞為間充質來源并具有干細胞特性。

本實驗基于牙周病的治療現(xiàn)狀和組織工程技術的發(fā)展背景，研究ICA應用于組織工程領域治療牙周病的可行性。有研究[5,9-14]已經(jīng)證實，ICA在促進成骨細胞的功能方面具有重要的作用。ICA可顯著促進大鼠成骨細胞的分化與成熟，促進人臍帶間充質干細胞、羊骨髓間充質干細胞和大鼠骨髓間充質干細胞的骨向分化與增殖；能抑制大鼠破骨細胞的分化及細胞活性，降低其骨吸收能力，達到促進成骨細胞增殖和分化的作用；并具有促進人成骨細胞增殖和分化的功能，具有促進骨形成的生理活性。本實驗中，以1×10-7mol·L-1ICA作用于hPDLSCs，觀察ICA對hPDLSCs生長增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)：ICA從培養(yǎng)的第2天開始，可以明顯促進hPDLSCs的增殖，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞數(shù)量逐漸增多。ALP是成骨細胞、成牙骨質細胞等骨化細胞的標志性物質，在成骨細胞、成牙骨質細胞剛開始形成骨和牙骨質時，ALP活性顯著增加，因此ALP可以作為細胞骨向分化的評價指標[15]。本實驗中，1×10-7mol·L-1ICA作用于hPDLSCs后，ALP活性明顯升高，提示ICA具有促進hPDLSCs的增殖和骨向分化的能力。Runx2、ColⅠ、OPN和OCN是一種指示骨新陳代謝變化過程的靈敏、準確和特異性的指標性物質，可以反映細胞的成骨活性[16]。本實驗中，1×10-7mol·L-1ICA作用于hPDLSCs后，4種基因的表達均明顯增高，說明ICA具有明確的促進hPDLSCs骨向分化的作用。

羥磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性[17]，是牙槽骨、牙骨質、牙齒的主要無機成分。nHAC作為一種典型的生物材料，是納米微晶狀態(tài)的細胞外基質材料，也是良好的牙周組織工程支架材料，植入人體后能在短時間內(nèi)附著于人體組織，并最終與體內(nèi)的軟硬組織緊密結合，現(xiàn)已成為廣泛應用的植骨代用品[18]。nHAC及其復合材料的構想源于天然組織，牙齒就是由nHAC晶體和有機高分子組成的納米復合材料[19]。將nHAC及其復合材料應用于牙周組織工程，是將材料技術應用于建立牙齒新附著的嘗試，是組織工程領域非常重要的研究課題[20]。本實驗以nHAC作為支架材料，將hPDLSCs接種到nHAC三維支架上，經(jīng)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs可以在nHAC上牢固貼附，生長旺盛，伸展充分。本實驗進一步將hPDLSCs與nHAC復合支架經(jīng)ICA作用72 h后植入小鼠體內(nèi)，術后30 d，經(jīng)組織學觀察，結果可見：經(jīng)ICA作用的nHAC周圍出現(xiàn)大量的編織骨，骨小梁表面可見覆以不規(guī)則形狀的成骨細胞，網(wǎng)狀骨小梁間可見新生骨組織和血管；未經(jīng)ICA作用的對照組nHAC周圍可見類骨質及少量編織骨。該結果證實ICA在體內(nèi)對hPDLSCs的增殖及骨向分化也具有明顯作用。

通過本實驗的研究，證實ICA作為生長因子，hPDLSCs作為種子細胞在牙周組織工程中的應用是可行的，這為牙周組織工程的發(fā)展提供了新的思路。

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