固定化HPR催化降解染料廢水中的剛果紅

王亞麗等

摘要：研究了以固定化的辣根過氧化酶為催化劑，催化H2O2氧化降解剛果紅染料，考察了影響剛果紅染料降解率的幾個重要因素，包括pH、溫度、反應(yīng)時間、H2O2濃度、染料初始濃度等，確定其最佳條件為pH 3.5，固定化酶用量0.5 g，H2O2濃度1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間30 min，降解率達(dá)到91.6%。催化劑重復(fù)使用4次后降解產(chǎn)率仍可達(dá)到22.0%，同時采用質(zhì)譜對降解后的產(chǎn)物進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：剛果紅染料；辣根過氧化物酶；固定化；降解

中圖分類號：O643.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4441-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.014

染料廢水中含有多種具有生物毒性或?qū)е氯梭w病變的有機物，癌癥與環(huán)境因子有關(guān)，致癌物是有毒的有機物，其中包含部分有機染料，如偶氮類染料，它占全球所用染料的80%，因其結(jié)構(gòu)中的偶氮基常與一個或多個芳香環(huán)系統(tǒng)相連構(gòu)成一個共軛體系作為染料的發(fā)色體，對人體有極不利的影響。據(jù)2004年統(tǒng)計我國每年大約有2×103～3×103 t的染料會直接隨著廢水排入環(huán)境中，而目前我國工業(yè)廢水的治理率約為87.4%，治理合格率僅為處理總量的63%[1]。含有偶氮類染料的工業(yè)廢水的特點是色度大，組成復(fù)雜，難降解，對環(huán)境的污染很大，同時因其化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，生物可降解性低，因此偶氮染料廢水是公認(rèn)的難治理的高濃度有機廢水[2-5]。剛果紅染料是典型的雙偶氮染料，分子式為C32H22N6Na2O6S2，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，它可以作為一種酸堿指示劑來使用，當(dāng)pH小于3.5時為藍(lán)紫色，當(dāng)pH大于5.3時為紅色。它也被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙和印染等行業(yè)[2，3]。

目前，國內(nèi)外常用的處理染料廢水的方法有3大類：物理法、化學(xué)法和生物法。其中生物法因其處理方法簡單易行，二次污染較少而備受關(guān)注[6，7]。生物法主要以酶作催化劑，辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是血紅素類過氧化物酶的一種，因其高效的催化性能已成為重要的生物催化劑。它可以處理一些難生物降解的人工合成染料，如含偶氮基團(tuán)、多環(huán)類有機物、高聚物有機物，也被廣泛用于有機合成、生物轉(zhuǎn)化、發(fā)光檢測、免疫檢測、相關(guān)酶檢測、臨床化學(xué)、電化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域。

本實驗以海藻酸鈉為載體，戊二醛作為交聯(lián)劑，進(jìn)行辣根過氧化物酶的固定化，并用固定化后的辣根過氧化物酶催化H2O2對雙偶氮染料剛果紅進(jìn)行降解處理，通過紫外分光光度計的檢測對降解條件進(jìn)行優(yōu)化，通過質(zhì)譜對降解過程進(jìn)行分析。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

辣根過氧化物酶（阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）；海藻酸鈉（AR，阿拉丁試劑有限公司）；無水氯化鈣（AR，汕頭市西隴化工廠）；剛果紅（指示劑，AR，阿拉丁試劑有限公司）；30%的H2O2（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

紫外可見分光光度計（UV-1700型，島津國際貿(mào)易上海有限公司）；微量連續(xù)可調(diào)移液器（10-1 000 μL，上海艾本徳有限公司）；液相色譜儀（LC-20AT，日本島津制作所）；電噴霧質(zhì)譜儀（MS5973，德國布魯克公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣根過氧化物酶的固定化 將1.25 g海藻酸鈉加熱溶解于25.0 mL水中，緩慢加入2.5 mL 濃度為0.097 0 g/mL的辣根過氧化物酶溶液，置于恒溫振蕩器中振蕩10 min，使酶與海藻酸鈉溶液混勻，再分別加入10.0 mL濃度為1.0 mol/L的氯化鈣溶液，繼續(xù)在恒溫振蕩器中振蕩20 min，然后取出靜置6 h 后，用蒸餾水充分洗滌5次，然后將固定化辣根過氧化物酶轉(zhuǎn)移至5%的戊二醛溶液中，于30 ℃下交聯(lián)1 h。再用生理鹽水洗滌8次，盡可能去除殘余的戊二醛[8-11]。將制備好的固定化酶置于4 ℃冰箱中備用[12]。

1.2.2 磷酸鹽緩沖溶液的配制 配置0.1 mol/L的pH為1～8的磷酸緩沖溶液備用，因為酶催化降解一般都在某一穩(wěn)定的pH下進(jìn)行。

1.2.3 剛果紅染料溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.174 2 g剛果紅于50 mL容量瓶中定容，用超純水配制成濃度為5 mmol/L的染料儲備液，以備稀釋成所需不同濃度的剛果紅染料溶液。溶液均置于陰暗干燥處保存。

1.2.4 剛果紅染料特征吸收波長的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在紫外-可見分光光度計上，用1 cm的石英比色皿，以超純水為參比，在400～540 nm的波長范圍內(nèi)對剛果紅染料溶液掃譜，每隔10 nm記錄不同波長下的吸光度，繪制吸收曲線，如圖2所示，確定其特征吸收波長為488 nm。

在5.0 mL的離心管中，加入1 800 μL pH為2的磷酸緩沖溶液、200 μL 不同濃度的剛果紅染料溶液，30 ℃恒溫10 min，取出溶液加入到1.0 cm的石英比色皿中測定不同濃度的剛果紅染料溶液在其特征吸收波長488 nm處的吸光度，以吸光度-濃度作圖得出剛果紅染料的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，剛果紅的初始濃度在0.2～1.6 mmol/L間呈線性關(guān)系。因此，把該濃度范圍應(yīng)用于剛果紅降解的整個實驗中。

1.2.5 脫色率的計算 用紫外可見分光光度計測定剛果紅在其特征吸收波長488 nm處的吸光度值，按下面公式計算染料脫色率：

η=（A0-At）/A0×100%

式中，η為剛果紅的脫色率，A0為剛果紅的初始吸光度，At為t時刻剛果紅的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化HPR用量對染料剛果紅降解的影響

將固定好成凝膠狀的HPR分別稱取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g加入到200 μL 底物濃度為0.1 mmol/L的剛果紅染料溶液中，使反應(yīng)體系的pH為4，在40 ℃的恒溫槽中進(jìn)行試驗，加入1.0 mmol/L H2O2溶液反應(yīng)。該染料較易被固定化的辣根過氧化物酶降解，反應(yīng)25 min后不同用量的固定化HPR對染料剛果紅的脫色率分別為54.3%、71.2%、82.9%、82.2%、81.8%。當(dāng)酶用量在0.5 g以上時，隨著酶用量的增加，剛果紅染料的脫色率基本不變。因此，選擇固定化HPR的用量為0.5 g。

2.2 緩沖溶液pH對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

將不同pH的緩沖溶液加入5 mL離心管中，各加入200 μL 1.0 mmol/L的剛果紅溶液，然后分別加入1.0 mmol/L的H2O2溶液，最后加入固定化酶，恒溫40 ℃，反應(yīng)時間為25 min，考察不同pH的磷酸緩沖溶液對染料脫色降解率的影響，結(jié)果如圖4所示。在pH為3.5時降解率最大，為83.2%，而當(dāng)pH在2～3時對降解率影響不大，當(dāng)pH大于4時降解率逐漸下降。所以，最佳pH為3.5。pH越大，降解率越低，這主要因為剛果紅是一種酸性染料，pH越大，固定化辣根過氧化物酶對底物的作用能力減弱。

2.3 H2O2濃度對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

根據(jù)上述試驗方法，使反應(yīng)保持pH為3.5、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、酶用量等條件同上，考察H2O2濃度對降解率的影響。選取H2O2濃度范圍0.2～2.0 mmol/L，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在H2O2的濃度為1.0 mmol/L時降解率最大，此時降解效果最好，降解率為84.3%，如果H2O2濃度繼續(xù)增大，對降解率影響不大，所以最佳H2O2的濃度為1.0 mmol/L。

2.4 反應(yīng)時間對固定化HPR降解染料剛果紅的影響

緩沖溶液保持pH為3.5，恒溫槽的溫度為40 ℃，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，選取反應(yīng)時間5～40 min，考察反應(yīng)時間對染料脫色降解的影響。從圖6中可以看出，開始反應(yīng)時隨著時間的延長降解效果越來越好，當(dāng)反應(yīng)持續(xù)到30 min時降解率達(dá)到最大值，此時降解率為85.0%，而當(dāng)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，降解率基本保持不變，所以最佳反應(yīng)時間為30 min。

2.5 溫度對固定化HPR降解剛果紅的影響

為了提高降解效率，繼續(xù)考察反應(yīng)溫度對降解率的影響，緩沖溶液保持pH為3.5，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，底物濃度0.1 mmol/L，反應(yīng)時間30 min，選取溫度分別為15、20、30、40、50、60、70 ℃，考察反應(yīng)溫度對剛果紅染料降解率的影響。由圖7可以看出，固定化的HRP在40 ℃時的活性最高，降解率達(dá)到89.4%，而隨著溫度的升高，酶活性逐漸下降，導(dǎo)致降解效果變差，所以選取最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。

2.6 染料初始濃度對固定化HPR降解剛果紅的影響

對染料的初始濃度進(jìn)行考察，保持緩沖溶液的pH為3.5，恒溫槽的溫度為40 ℃，氧化劑H2O2的濃度為1.0 mmol/L，反應(yīng)時間為30 min，選取不同的底物濃度：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L，考察不同的底物濃度對降解率的影響。由圖8可以看出，不同的底物濃度對降解率影響較大，隨著底物濃度的增大，降解率逐漸減小，本實驗的最佳底物濃度為0.1 mmol/L，降解效率達(dá)到91.6%。

通過以上試驗得出降解的最佳條件：pH為3.5，固定化酶用量為0.5 g，過氧化氫濃度為1.0 mmol/L，底物濃度為0.1 mmol/L時，在40 ℃的恒溫槽中加熱反應(yīng)30 min得到最大降解率為91.6%。

2.7 固定化HPR的最大循環(huán)次數(shù)

將0.5 g 固定化辣根過氧化物酶和pH為3.5的緩沖溶液加入至200 μL底物濃度為0.1 mmol/L的剛果紅染料液中，最后加入濃度為1.0 mmol/L的H2O2溶液，在40 ℃恒溫槽中降解反應(yīng)，30 min后反應(yīng)結(jié)束，計算降解率；然后將反應(yīng)液進(jìn)行處理，濾去所有液體，剩下固定化的HPR。并用適量的緩沖液洗滌固定化HPR 4～5次，然后加入相同濃度和體積的剛果紅溶液，在相同條件下進(jìn)行新的實驗，如此重復(fù)4次。由圖9可以看出，隨著固定化HPR降解染料次數(shù)的增加，染料脫色率逐漸降低。酶重復(fù)使用4次后，剛果紅染料的脫色率從91.5%下降至22.0%。

2.8 染料降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

為確定降解產(chǎn)物，對剛果紅染料的降解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。反應(yīng)后的混合液用乙酸乙酯萃取3次，有機相合并后旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解，質(zhì)譜分析。結(jié)果如圖10所示。在正負(fù)不同離子模式下的質(zhì)譜圖。

據(jù)報道，偶氮染料的氧化降解在文獻(xiàn)中提出了2個重要的途徑：一個對稱的偶氮鍵斷裂和一個不對稱的[13，14]偶氮鍵斷裂。Lopez等[15]研究表明，用錳過氧化物酶降解橙黃Ⅱ溶液時2種斷裂方式都存在，所用的分析方法為1H NMR和ESI-MS質(zhì)譜分析。本實驗采用ESI-MS質(zhì)譜分析，對降解產(chǎn)物的推測結(jié)果表1所示。

根據(jù)表1推測了剛果紅降解的一種可能途徑。首先，剛果紅的2個偶氮雙鍵發(fā)生斷裂，分解成兩分子的1，8-二氨基-3-萘磺酸鈉和一分子的4，4-二氨基聯(lián)苯；接著，分解成的4，4-二氨基聯(lián)苯中的氨基也會被氧化成為亞硝基，又生成4，4-二亞硝基聯(lián)苯，又被氧化成硝基，生成4，4-二硝基聯(lián)苯，如果繼續(xù)氧化，可能導(dǎo)致聯(lián)苯斷裂，生成苯酚、苯二氮烯等小分子物質(zhì)。同樣，生成的1，8-二氨基-3-萘磺酸鈉中的氨基被氧化成亞硝基，生成1，8-二亞硝基-3-萘磺酸鈉，亞硝基進(jìn)一步被氧化成硝基，形成1，8-二硝基-3-萘磺酸鈉。當(dāng)然，剛果紅分子本身結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，并帶有相當(dāng)多的官能團(tuán)，因此所推斷的產(chǎn)物可能只是其降解過程中生成產(chǎn)物的一部分。降解過程主要利用電子得失，使不飽和鍵斷開，將大分子的發(fā)色基團(tuán)氧化分解成無色無毒或毒性較小的小分子物質(zhì)，最終達(dá)到降解目的。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明固定化的辣根過氧化物酶完全可以降解剛果紅染料，而且固定化的辣根過氧化物酶跟辣根過氧化物酶溶液相比，能夠重復(fù)使用，這樣不僅可以節(jié)約成本，而且可以提高降解率。同時本降解途徑采用的氧化劑為H2O2，符合綠色降解的要求。對降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析證實了固定化辣根過氧化物酶催化H2O2氧化偶氮染料剛果紅經(jīng)水解酸化降解成了結(jié)構(gòu)更簡單的中間產(chǎn)物。本研究作為探究性實驗，其主要目的是用于工業(yè)廢水的處理，通過實驗說明固定化的辣根過氧化物酶確實可以對染料剛果紅進(jìn)行降解。

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