馬寧++魏姜勉++張亮

摘 要：通過對夏南牛瘤胃樣本進(jìn)行微生物富集培養(yǎng)，篩選、獲得一株纖維素高效降解細(xì)菌ZJ08，分子鑒定確定該菌屬于假黃單胞菌屬，其纖維素酶活的最適溫度為55℃，最適pH為5.0，是一株具有較強耐酸特性的纖維素降解菌株，具有潛在的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：假黃單胞菌；牛瘤胃；微晶纖維素；降解

中圖分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）06-0007-02

反芻動物的瘤胃消化系統(tǒng)是一個小型的“纖維素降解發(fā)酵系統(tǒng)”，瘤胃中棲息著大量微生物，其中部分真菌和細(xì)菌可以分泌纖維素酶以輔助消化并吸收富含纖維素的飼料。因而瘤胃中纖維素降解微生物在新飼料研發(fā)、新能源開發(fā)及環(huán)境治理等方面有著潛在的應(yīng)用價值。本研究從夏南牛瘤胃中分離到1株能夠利用微晶纖維素的微生物，對其進(jìn)行了鑒定和酶學(xué)特性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 微晶纖維素購自上海生工生物有限公司，CMC購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。剛果紅、（NH4）2SO4、 K2HPO4、 NaH2PO4、 MgSO4·7H2O、 NaCl、 NH4H2PO4、KCl、 蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏等購自國內(nèi)各生物試劑公司。引物EU8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和EU1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）由上海Sangon公司合成。DNA聚合酶、T4 Ligase、pMD-18T Vector購自TaKaRa大連公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基參照《分子克隆實驗指南》中的配方。SX固體培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 2.5 g，K2HPO4 2.0 g，NaH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微晶纖維素 5.0 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.1.3 菌種 供試菌ZJ01至ZJ34等34個菌株由駐馬店市獸藥飼料（動物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心提供。將-40℃保存的34個供試菌株在SX培養(yǎng)基中劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)活化。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅染色法 將待測菌株接種于SX固體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)6 d后，用0.1%的剛果紅溶液浸泡平板10 min，用0.85%的 NaCl水溶液漂洗15 min，觀察平板上是否出現(xiàn)透明降解圈，以驗證纖維素是否被有效降解。

1.2.2 菌種發(fā)酵及pH變化檢測 用打孔器挑取經(jīng)28 ℃活化培養(yǎng)5d的菌體5塊，置于150 mL的SX液體培養(yǎng)基中，100 r/min，28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL上發(fā)酵液，10 000 r/min離心3 min后取上清液，計測定發(fā)酵液pH值，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 基因組DNA提取 挑取目標(biāo)菌株單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，120 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)過夜；5 000 r/min離心10 min收集沉淀，用0.85 % NaCl沖洗2次；將沉淀懸浮于0.5 mL 0.85% NaCl溶液中，每管加入0.4 μL100 mg/mL溶菌酶，37 ℃振蕩1 h；加入40 μL 10% SDS水溶液，再加入25 μL 100 mg/mL的蛋白激酶K，37 ℃下震蕩3～4 h，待溶液完全透明后，置于60 ℃下處理20 min，使蛋白酶失活；每管加入一倍體積的酚-氯仿，輕輕混勻，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀析出；15 ℃，5 000 r/min離心15 min。取上層液體移入1.5 mL離心管中，向管中加入1/10體積3 mol/L CH3COONa；緩慢加入2.5倍體積-20 ℃下預(yù)處理的無水乙醇，混勻后置于-80℃冰箱中冷凍30 min，取出后在4 ℃下12 000 r/min離心15 min；棄上清，向管中加入0.5 mL 的-20℃的70%乙醇溶液，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清后于超凈工作臺中過夜干燥，加入適量的ddH2O 使DNA溶解，將DNA 置于-20℃冰箱中保存待用。

1.2.4 菌株16S rDNA擴(kuò)增與測序 用原核生物通用引物EU8F和EU1492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系總體積25 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測及凝膠回收試劑盒純化，克隆到pMD 18-T Vector，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 CMCase 酶活力的測定 取培養(yǎng)6 d的CM液體發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液用于酶活測定。具體方法如下：吸取粗酶液0.2 mL，加入1.8 mL 1% （W/V）CMC-Na 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.8），經(jīng)50 ℃恒溫水浴30 min 后， 按DNS法在540 nm下測定吸光值，換算還原糖生成量， 計算CMC 酶活。分別在不同溫度、不同pH下測定CMC酶活。在酶反應(yīng)體系中分別加入0.01 mol/L 的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+ 和Pb2+等金屬離子，測定其對纖維素酶活力的影響。

酶活單位按照國際單位規(guī)定定義為以每分鐘催化纖維素水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。CMC酶活（U）=A×5×25×1000/30（μmol/mL·min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌株的篩選

將34株供試菌活化后接種至SX固體培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)8 d，篩選出生長作為旺盛的ZJ08菌作為目標(biāo)菌株，并對其進(jìn)行剛果紅染色，出現(xiàn)一個明顯的無色透明圈。剛果紅與纖維素等多糖結(jié)合形成剛果紅-多糖復(fù)合物呈現(xiàn)紅色，當(dāng)多糖物質(zhì)被降解后，剛果紅則與之分離而脫色。

2.2 菌株發(fā)酵液pH值變化

將ZJ08菌接種于SX液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，120 r/min下恒溫培養(yǎng)，每24 h取樣測定pH值。第三天，發(fā)酵液pH值開始迅速下降，第六天時pH降至2.30，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加，pH值開始回升。

2.3 菌株的分子鑒定

用原核生物通用引物EU8F和EU1492R對ZJ08菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆并測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，選取同源性較高的菌株，使用Mega 5.0軟件的MCL（Maximum Composite Likelihood）法計算進(jìn)化距離，用NJ（Neighbor-Joining）法和Bootstrap法產(chǎn)生1 000個聚類樹，按照多數(shù)規(guī)則法（Majority-rule）得到了一個最“逼真”的系統(tǒng)發(fā)育樹。ZJ08菌株屬于假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas sp.），與對芳香烴物質(zhì)間苯二酚具有較強降解能力的QQDP512菌株的同源性高達(dá)99%，與對有機殺菌劑百菌清具有很好降解能力的CTN-8菌株的同源性達(dá)99%。

2.4 酶學(xué)特性

2.4.1 酶的最適反應(yīng)條件 在30～80 ℃范圍內(nèi)，分別測定不同溫度下的酶活力。結(jié)果表明，ZJ08菌株的酶活力在45～65 ℃范圍內(nèi)均能保持較高水平的酶活，在55 ℃下酶活力最高，達(dá)到96.4 U/mL。

ZJ08粗酶液只在初始pH 4.0～6.0范圍內(nèi)具有較高活性，當(dāng)pH值高于8.0或低于3.0，相對酶活僅有不到20%。

ZJ08菌株的酶活跟反應(yīng)體系中的金屬離子種類有直接聯(lián)系。在Fe2+和Mn2+的作用下，相對酶活均提高100%以上；而Pb2+ 、Hg+、和Cu2+等重金屬均可使酶活降低80%以上，對酶蛋白有強烈的抑制作用。

2.4.2 酶活熱穩(wěn)定性分析 將粗酶液分別置于55～85 ℃的溫度范圍內(nèi)水浴處理30 min，于55℃下測定相對酶活，從而進(jìn)行熱穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，當(dāng)粗酶液于65～85 ℃高溫處理30 min后，殘留活力迅速下降至40%以下；60 ℃處理30 min后，酶活力下降至53%； 55 ℃處理30 min后，酶活力仍為100%。

3 討論

本研究選用微晶纖維素為單一碳源，對從牛瘤胃中分離出34種微生物進(jìn)行分離篩選，并獲得一株纖維素高效降解菌ZJ08，通過分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株屬于假黃單胞菌屬。這也是首次證明假黃單胞菌屬菌株具有纖維素的能力。此外，該屬的部分菌株對于一些復(fù)雜的有機化合物（如百菌清、間苯二酚）具有較好的降解作用，這從一定程度上說明了假黃單胞菌屬對一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機化合物有獨特的降解能力。

ZJ08菌株具有較強的纖維素降解能力和獨特的產(chǎn)酸特性，在畜禽飼料、化工原料生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域有著較高的利用前景。

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