樺褐孔菌子實體與菌絲體營養(yǎng)成分比較分析

董愛榮，劉雪峰，宋福強

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾 濱 150040；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080）

樺褐孔菌子實體與菌絲體營養(yǎng)成分比較分析

董愛榮1，劉雪峰1，宋福強2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾 濱 150040；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080）

將液體培養(yǎng)的菌絲體與野生子實體烘干磨粉處理，對其營養(yǎng)成分測定分析，結(jié)果表明：菌絲體粗多糖含量（7.43 g/100 g）顯著高于子實體粗多糖含量（2.31 g/100 g），二者均由果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖7 種組成；凱氏定氮法測得子實體粗蛋白含量為6.69 g/100 g，菌絲體粗蛋白含量為21.08 g/100 g；全自動氨基酸分析儀測得子實體含14 種氨基酸，菌絲體含16 種氨基酸；原子吸收分光光度計測得樺褐孔菌中含有大量K、Fe、Ca、Zn、Mg元素，少量Na、Mn、Se。研究結(jié)果表明樺褐孔菌的菌絲體營養(yǎng)成分比較豐富，可以代替子實體應(yīng)用于食品及藥品行業(yè)中，緩解子實體這種珍稀野生資源的不足。

樺褐孔菌；營養(yǎng)成分；單糖組成；氨基酸；礦物元素

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）俗稱樺癌褐孔菌，主要寄生于白樺樹（Betula platyphylla）等闊葉樹活立木的樹皮下或倒木枯干上。其菌核可以在砍伐后的枯干上生存6 a之久，菌絲體耐受低溫能力極強，主要分布于北緯45°～50°地區(qū)的苦寒地帶，如俄羅斯、中國黑龍江大小興安嶺、吉林省長白山等地區(qū)［1］。

隨著對真菌活性物質(zhì)研究的深入，樺褐孔菌的藥用價值、營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值已經(jīng)引起人民的廣泛關(guān)注，成為各個行業(yè)的熱門開發(fā)領(lǐng)域［2］。樺褐孔菌多糖、三萜、多酚類天然抗癌藥物物質(zhì)可以作為保健藥品、健康食品、保健飲料、微膠囊的主要原料，其天然色素可在食品添加劑、茶葉的深加工、化妝品行業(yè)中應(yīng)用［3-10］。蔡建秀等［11］以樺褐孔菌人工培養(yǎng)菌絲體為材料，對樺褐孔菌蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、氨基酸、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分進行了分析及評價。高娃等［12］對樺褐孔菌子實體多糖進行了提取研究。玄光善等［13］對樺褐孔菌多糖進行純化，并對其中的單糖組成進行了研究。樺褐孔菌（Inonotus obliquus）生長環(huán)境特殊，自然資源十分有限，子實體人工栽培困難，而菌絲體液體培養(yǎng)技術(shù)成熟。對同一來源的樺褐孔菌子實體及營養(yǎng)體的營養(yǎng)成分進行比較分析，可以促進菌絲體代替子實體應(yīng)用于食品及藥品行業(yè)中，緩解子實體野生資源的不足。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

褐孔菌子實體采自黑龍江呼中國家級自然保護區(qū)白樺林的野生樺（采集人：董愛榮、劉雪峰），采用傘菌分離法，分離獲得純菌種，根據(jù)子實體、菌絲體生長特征，由東北林業(yè)大學(xué)劉雪峰教授鑒定其為樺褐孔菌。菌種用打孔器轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基里28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，搖培結(jié)束后將培養(yǎng)液離心取菌絲體，菌絲體經(jīng)去離子水水洗，再離心，這樣重復(fù)操作幾次，收集菌絲體，研磨過篩待測。

苯酚、氯仿、無水甲醇、無水乙醇、正丁醇、異戊醇、硫酸、鹽酸、硼酸、硝酸、蒽酮、硫酸鉀、氫氧化鈉、碘化鉀、單質(zhì)碘、硼砂、碳酸鋇、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-1450超凈工作臺 蘇州金信凈化設(shè)備工程有限公司；MLS-3750壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；HNY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器、EMS-9A恒溫磁力攪拌器 天津市歐諾儀器有限公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱、HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；H1650-W離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-100DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi儀器公司；KJELTEC-8100全自動凱氏定氮儀 美國Foss公司；L-8800全自動氨基酸分析儀 天美科技有限公司。

1.3方法

1.3.1粗多糖的提取及其含量測定

1.3.1.1超聲波酶法提取粗多糖

干燥至質(zhì)量恒定的樺褐孔菌子實體、菌絲體，粉碎成粉末過60目篩，取100 g樣品用95%乙醇溶液回流提取3 h，濾液倒掉，重復(fù)提取3 次，除去樣品中的生物堿、色素、多酚類和低聚糖，棄濾液，烘干濾渣。處理后的濾渣按料液比1∶40（g/mL）加水，待水浴鍋溫度升至45℃時，加入400 U/g纖維素酶和600 U/g中性蛋白酶，在功率125 W、溫度55 ℃超聲提取器中作用2 h，升溫至80 ℃滅酶，并在此溫度條件下恒溫浸提3 h后，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收，加95%乙醇溶液沉至乙醇終體積分數(shù)80%，離心收集沉淀，用無水乙醇、乙醚、丙酮交替洗滌2 次，干燥得粗多糖［14］。

1.3.1.2標準曲線的制作

稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖100.000 0 mg，加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，即得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL標準葡萄糖溶液。精密量取上述溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0 mL分別置10 mL具塞試管中，加蒸餾水補充至2.0 mL分別加5%苯酚試劑1.0 mL搖勻，迅速滴加5.0 mL濃硫酸搖勻，放置10 min后置沸水浴加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。同一處理重復(fù)3 次，以標準葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程。

1.3.1.3粗多糖含量的測定

稱取干燥至質(zhì)量恒定的樺褐孔菌粗多糖100.000 0 mg，溶解于蒸餾水中，定容至1 000 mL，取粗多糖樣品溶液2 mL于具塞試管中，按1.3.1.2節(jié)方法操作測定吸光度，同一處理重復(fù)3次，按照回歸方程計算，得到粗多糖含量。

1.3.2粗多糖中單糖組分的測定

1.3.2.1粗多糖樣品水解

取粗多糖樣品20.00 mg，加3 mL 1 mol/L的H2SO4溶液到10 mL安瓿管封管105 ℃恒溫水解8 h，取出冷卻至室溫用碳酸鋇完全中和，放置過夜，8 000 r/min離心10 min，取上清液，待衍生［15］。

1.3.2.2衍生化處理

分別精密稱取果糖18.0 mg、木糖15.0 mg、鼠李糖18.2 mg、阿拉伯糖15.0 mg、核糖13.4 mg、葡萄糖15.0 mg、甘露糖18.0 mg、半乳糖14.6 mg、半乳糖醛酸19.4 mg，分別溶解于100 μL的去離子水中混勻，各取出10 μL，稀釋定容至10 mL，混勻，得1 mmol/L的單糖標準溶液。取上述9 種單糖標準品溶液和多糖水解樣品溶液各100 ?L加100 ?L 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）無水甲醇液、100 μL 0.3 mol/L氫氧化鈉溶液，渦旋混合30 s，70 ℃水浴反應(yīng)1 h，取出冷卻至室溫，加0.3 mol/L鹽酸中和。加1 mL氯仿振蕩混合3 min，靜置20 min，取上清重復(fù)萃取3 次，得衍生化樣品，同時做平行樣與空白樣對照［16］。

1.3.2.3單糖組分的測定

衍生化樣品、75 mmol/L運行硼砂緩沖液（pH 9.8）、去離子水、0.1 mol/L氫氧化鈉均過0.45 μm的濾膜過濾，超聲脫氣后，高效毛細管電泳上樣，記錄圖譜。多糖樣品圖譜與標準單糖 圖譜對照，根據(jù)出峰時間和峰面積進行組成成分分析。二極管陣列檢測器；石英毛細管柱（58.5 cm×75 μm，有效長度48.5cm）；柱溫25 ℃；電壓15 kV；壓力進樣0.5 Pa×20 s；檢測波長200 nm；32 KaratTMSoftware 8.0數(shù)據(jù)處理軟件［17-18］。

1.3.3粗蛋白含量的測定

通過凱氏定氮儀進行蛋白質(zhì)檢測，選取樣品0.20～2.00 mg，加入7g硫酸鉀、0.40 g無水硫酸銅、20 mL濃硫酸于消化管中進行消化反應(yīng)，至液體藍綠色并澄清后，繼續(xù)加熱1 h。消化好的樣品冷卻至室溫，定容到100 mL容量瓶中。混勻備用，吸取消煮液10.00 mL注入蒸餾器的內(nèi)室，另取內(nèi)加硼酸溶液（20 g/L）及2 滴指示劑的150 mL三角瓶，開啟自動凱式定氮儀，將消化產(chǎn)生的NH4正轉(zhuǎn)變成NH3，蒸餾10 min后待指示劑變色，流出的三角瓶內(nèi)液體積約達50～60 mL時，停止蒸餾，標準硫酸滴定餾出液指示劑顏色變?yōu)榈凵瞻诇y定的滴定終點顏色），根據(jù)酸的消耗量計算總氮量。同時進行平行樣和空白對照［19］。

1.3.4總氨基酸種類及其含量的測定

稱量樣品20.00 mg于安瓿瓶中，加6 mol/L鹽酸溶解，N2排凈空氣，酒精噴燈封口，放恒溫干燥箱中105 ℃水解24 h。完全水解的樣品倒入干燥皿中，65 ℃水浴揮發(fā)掉鹽酸后，加10 mL去離子水洗滌，重復(fù)3次，干燥。取干燥完全的樣品粉末用0.02 mol/L的鹽酸溶液溶解定容至10 mL，4 ℃冰箱冷藏；獲得處理液通過孔徑為0.22 μm的濾膜過濾。吸取1 mL處理液置于全自動氨基酸分析儀樣品瓶中進行總氨基酸含量檢測［20］。

1.3.5礦物元素含量的測定

所有容器耗材用硝酸浸泡24 h，樣品粉碎磨細過篩，精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的樣品5 mg，10%的硝酸（優(yōu)級純）消解樣品，定容到50 mL，過孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，進行K、Fe、Ca、Zn、Mg、Na、Mn、Se 8 種礦物元素測定，同一處理重復(fù)3 次，同時進行空白對照［21］。

2　結(jié)果與分析

2.1粗多糖含量對比

參照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》繪制標準曲線，可以獲得其方程為y=0.146 6x+ 0.000 1，其中R2=0.999 1，表明方程的擬合度較好。樺褐孔菌子實體和菌絲體中多糖含量如圖1所示。

圖1　樺褐孔菌子實體和菌絲體中粗多糖含量Fig.1　Crude sugar contents in fruiting body and mycelium of I. obliquus

真菌多糖是能夠提高人體免疫能力和抗性的物質(zhì)。測定得到的樺褐孔菌子實體粗多糖含量2.31 g/100 g、菌絲體粗多糖含量7.43 g/100 g，菌絲體多糖含量明顯高于子實體。菌絲體營養(yǎng)菌絲發(fā)達，生命活動活躍，需要大量碳水化合物。

2.2粗多糖中單糖組分對比

2.2.1標準單糖譜圖

將9 種單糖標準品混合后進行電泳分析，圖2為混合單糖毛細管區(qū)電泳圖譜。

圖2　混合單糖毛細管區(qū)帶電泳圖譜Fig.2　Capillary electrophoretogram of mixed monosaccharides

混合單糖樣品區(qū)帶電泳圖譜上出現(xiàn)了9 個明顯的峰，這些單糖得到了有效分離。對照各個單糖與混合單糖樣品譜圖中的出峰時間，得出下列標準單糖的電泳遷移時間如表1所示。

表1　混合單糖的遷移時間Table1　Migration times of mixed monosaccharides

從表1可以看出，單糖出峰順序依次為果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸。

2.2.2粗多糖樣品的單糖組分分析

樺褐孔菌子實體（圖3A）與菌絲體多糖（圖3B）經(jīng)過水解，PMP甲醇溶液衍生化后進行高效毛細管電泳。

圖3　子實體（A）和菌絲體（B）多糖毛細管區(qū)帶電泳圖譜Fig.3　Capillary electrop horetograms of polysaccharides from fruit body and mycelium

根據(jù)混合糖和樣品糖出峰時間的對應(yīng)關(guān)系，可知樺褐孔菌子實體、菌絲體多糖主要由木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，含有微量的果糖和阿拉伯糖。子實體和菌絲體多糖單糖組分的遷移時間、峰面積百分比見表2。

表2　子實體與菌絲體多糖樣品中單糖組分的遷移時間、峰面積百分比Table2　Migration times and peak area percentages of monosaccharide components of polysaccharides in fruit body and mycelium

對照多糖樣品與標準單糖圖譜，根據(jù)出峰時間和峰面積進行計算，樺褐孔菌子實體多糖中單糖組分物質(zhì)的量比為果糖∶木糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖=0.9∶5.6∶3.6∶1.2∶27.5∶6.0∶5.2；菌絲體中單糖組分物質(zhì)的量比為果糖∶木糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖=1.4∶3.2∶2.5∶1.0∶32.0∶3.6∶6.4。其中葡萄糖組分在子實體和菌絲體多糖中含量都是最大的；果糖組分在子實體含量最少，阿拉伯糖組分在菌絲體中含量最少。樺褐孔菌子實體多糖的單糖組分和菌絲體基本一致，野生真菌由于面對各種脅迫，蟲害等，會產(chǎn)生更多抗性成分、其中包括活性多糖。本實驗發(fā)現(xiàn)子實體多糖中木糖、鼠李糖和甘露糖含量較高，這些單糖都是非供能多糖，在體內(nèi)參與多種生理功能；而菌絲體則含有較多能量多糖如半乳糖，主要用于菌絲生長生殖。因此從多糖生理活性考慮，菌絲發(fā)酵在一定程度上不利于活性多糖，但是由于菌絲生長迅速，繁殖快，可以獲得更多多糖。出于多糖質(zhì)量考慮，還需要在樺褐孔菌菌絲發(fā)酵的過程中，施加一定的脅迫因子，以便生產(chǎn)較多高質(zhì)量活性多糖。

2.3粗蛋白含量對比

圖4　子實體和菌絲體中粗蛋白含量Fig.4　Protein contents in fruit body and mycelium of I. obliquus

可為機體提供能量的蛋白質(zhì)含量高低是衡量食品營養(yǎng)價值的重要標準之一，如圖4所示，經(jīng)過測定計算出子實體粗蛋白含量為6.69 g/100 g，菌絲體粗蛋白含量為21.08 g/100 g，菌絲體中的蛋白含量明顯高 于子實體。可能由于菌絲體生命活動代謝旺盛，蛋白表達頻繁。

2.4氨基酸種類及含量對比

圖5　子實體（A）和菌絲體（B）中氨基酸圖譜Fig.5　Amino acid profiles of I. obliquus fruit body and mycelium

經(jīng)過全自動氨基酸分析儀檢測，檢測出的子實體含氨基酸14 種（圖5A），分別為Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Arg、His、Ile*、Leu*、Phe*、Lys*、Thr*、Val*（*標注代表必需氨基酸，下同），其中包括6 種必需氨基酸Ile*、Leu*、Phe*、Lys*、Thr*、Val*和2 種半必需氨基酸Arg、His。菌絲體中檢測出16 種氨基酸（圖5B），分別為Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Arg、His、Tyr、Ile*、Leu、Phe*、Lys*、Met*、Thr*、Met*、Val*，其中包括7種必需氨基酸和Arg、His 2 種半必需氨基酸。

樺褐孔菌子實體和菌絲體中氨基酸種類和相應(yīng)的含量如表3所示。樺褐孔菌子實體氨基酸總量為5.011%，6種必需氨基酸Ile*、Leu*、Phe*、Lys*、Thr*、Val*含量占總氨基酸含量的33.62%，其中Asp、Ala含量較高，His、Lys*含量較低。而菌絲體氨基酸總量為19.948%，7 種必需氨基酸Ile*、Leu*、Phe*、Lys*、Met*、Thr*、Val*含量占總氨基酸含量的38.04%，其中Asp、Ala含量較高，His、Tyr、Met*、Val*含量較低，Cys含量最低。

表3　樺褐孔菌子實體、菌絲體中氨基酸種類和含量Table3　Amino acid composition of fruit body and mycelium

圖6　子實體和菌絲體中氨基酸含量Fig.6　Amino acid contents of mycelium and fruit body

將子實體和菌絲體中氨基酸組分及相關(guān)含量做成柱狀圖，對比分析結(jié)果如圖6所示。樺褐孔菌菌絲體中所測氨基酸含量（Cys除外）均高于子實體，與菌絲體的蛋白含量顯著高于子實體相一致。其中Asp、Ala、Leu*和Arg等在菌絲體中顯著高于子實體。樺褐孔菌子實體中Cys含量高于菌絲體，而Cys是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中惟一還原性氨基酸，從一個側(cè)面反映子實體生長的環(huán)境，有助于抵抗野外的氧化脅迫。

2.5礦物元素含量對比

子實體和菌絲體中均含有K、Fe、Ca、Zn、Mg、Na、Mn、Se等礦物元素。如圖7所示，子實體中有益礦物元素從高到低為K、Fe、Ca、Zn、Na、Mg、Mn、Se，含量依次為2 099、1 089、687、499、189、185、175、82 mg/100 g。菌絲體中有益礦物元素從高到低為K、Fe、Zn、Ca、Mg、Se、Na、Mn，含量依次為2 394、1 136、973、578、520、284、234、133 mg/100 g。對比可知，Ca和Mn在子實體中含量略高于菌絲體，Zn、Mg和Se在菌絲體中含量顯著高于子實體，而對于其他礦物元素，菌絲體中的含量均高于子實體，但并不顯著。子實體中Ca和Mn兩種元素較高可能源自野外環(huán)境的各種不利刺激，在野外條件下，各種生物、非生物脅迫需要有機體較強的抵抗能力。Mn能作為超氧化物歧化酶的一部分積極參與真菌抵抗脅迫，助其生長繁殖。

圖7　子實體和菌絲體中礦物元素含量Fig.7　Mineral elements contents in fruit body and mycelium of I. obliquus

3　結(jié) 論

營養(yǎng)成分含量對比，菌絲體明顯高于子實體，子實體粗多糖含量2.31 g/100 g、菌絲體粗多糖含量7.43 g/100 g；子實體粗蛋白含量6.69 g/100 g、菌絲體粗蛋白含量21.08 g/100 g；樺褐孔菌子實體含氨基酸14 種，菌絲體中檢測出16 種氨基酸；并且礦物元素含量豐富，含有大量K、Fe、Ca、Zn、Mg，少量Na、Mn、Se。

樺褐孔菌多糖中單糖組分由果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，子實體物質(zhì)的量比為0.9∶5.6∶3.6∶1.2∶27.5∶6.0∶5.2；菌絲體物質(zhì)的量比為1.4∶3.2∶2.5∶1.0∶32.0∶3.6∶6.4。

子實體和菌絲體中均含有K、Fe、Ca、Zn、Mg、Na、Mn、Se等礦物元素，礦物元素對比可知，Ca和Mn在子實體中含量略高于菌絲體，Zn、Mg和Se在菌絲體中含量顯著高于子實體，其他礦物元素，菌絲體中的含量均高于子實體，但并不顯著。

樺褐孔菌的菌絲體營養(yǎng)成分比較豐富，可以代替子實體應(yīng)用于食品及藥品行業(yè)中，緩解子實體這種珍稀野生資源的不足。

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Comparative Analysis of Nutrients in Fruit Bodies and Mycelia of Inonotus obliquus

DONG Airong1， LIU Xuefeng1， SONG Fuqiang2，*
（1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China；2. Key Laboratory of Microbiology， School of Life Science， Heilongjiang University， Harbin 150080， China）

Drying and milling were conducted on the liquid-cultured mycelia and fruiting body of Inonotus obliquus. Crude polysaccharides were significantly more abundant in mycelium than in fruiting body （7.43 g/100 g vs. 2.31 g/100 g）， both of which consisted of fructose， xylose， rhamnose， arabinose， glucose， mannose and galactose. Meanwhile， crude protein contents in mycelium and fruiting body were determined using the Kjeldahl method to be 6.69 g/100 g and 21.08 g/100 g，respectively. Amino acid profiles measured by amino acid analyzer suggested that the fruiting bodies contained 14 kinds of amino acids， and the mycelium contained 16 kinds of amino acids. Furthermore， as analyzed by atomic absorption spectrometry， both mycelium and fruiting body were rich in K， Fe， Ca， Zn and Mg along with small amounts of Na， Mn and Se. These results show that the mycelia of I. obliquus are rich in nutrients， and can be used as an alternative to the fruiting body as a rare wild mushroom in the food and medicinal industries.

Inonotus obliquus； nutrient component； monosaccharide composition； amino acid； mineral elements

TS201.3

A

1002-6630（2015）14-0096-06

10.7506/spkx1002-6630-201514019

2014-12-19

國家林業(yè)局公益性項目（201004079）

董愛榮（1971—），男，副教授，博士，研究方向為森林病理學(xué)、微生物學(xué)。E-mail：darlmy@tom.com

宋福強（1969—），男，教授，博士，研究方向為森林微生物。E-mail：0431sfq@163.com