楊麗君，梁君妮，曹　鵬，關(guān)麗麗

（1.威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264200；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000）

魚肉中氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

楊麗君1，梁君妮2，曹鵬2，關(guān)麗麗2

（1.威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264200；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000）

研究鯉魚魚肉基質(zhì)中氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法。通過添加氟苯尼考養(yǎng)殖鯉魚獲得樣品基質(zhì)，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，通過8 家實驗室協(xié)作定值的方式對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值和不確定度評估，結(jié)果表明樣品的均勻性良好，穩(wěn)定性可達(dá)36 個月，可以用于水產(chǎn)品中氟苯尼考?xì)埩魴z測質(zhì)量控制和相關(guān)的科研需要。

標(biāo)準(zhǔn)樣品；氟苯尼考；均勻性；穩(wěn)定性；不確定度

氟苯尼考是一種新型的酰胺醇類動物專用抗生素，具有抗菌譜廣、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，被畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用［1］。氟苯尼考在體內(nèi)分布較廣，半衰期長，具有胚胎毒性和耐藥性，在動物組織中殘留會嚴(yán)重危害消費者的健康與安全。隨著氟苯尼考在養(yǎng)殖中大量、不規(guī)范應(yīng)用，它在畜禽、水產(chǎn)品等動物性食品中的殘留問題也日益被重視［2］。我國農(nóng)業(yè)部公告規(guī)定，氟苯尼考在水產(chǎn)品的肌肉和皮脂最高殘留限量不得超過1 000 μg/kg；日本規(guī)定，氟苯尼考在魚類中的殘留限量不得超過200 μg/kg；美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定水產(chǎn)品中氟苯尼考的殘留限量不得超過100 μg/kg。本研究從養(yǎng)殖到定值進(jìn)行探討，研制了性質(zhì)穩(wěn)定、可長期保存的氟苯尼考凍干基體標(biāo)準(zhǔn)樣品。

目前氟苯尼考的檢測方法有高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，在食品獸藥殘留檢測過程中，通常采用加標(biāo)回收實驗作為質(zhì)量控制的手段。但與實物標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，加標(biāo)回收實驗是一種模擬陽性樣品，難以反映出真正陽性樣品的提取效率，如歐盟明確要求動物源食品獸藥殘留檢測必須采用基體標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行過程質(zhì)量控制。

雖然我國食品相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)樣品不少，但目前標(biāo)準(zhǔn)樣品主要集中于無機元素方面，含獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究較少。本研究以鯉魚為養(yǎng)殖對象，模擬用藥得到天然污染的原料，經(jīng)制備得到氟苯尼考實物標(biāo)樣，該樣品均勻、穩(wěn)定，有助于對氯霉素類的藥品進(jìn)行監(jiān)測或作為實驗室質(zhì)控樣品。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗用鯉魚購于市場。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物（純度＞99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merk公司；乙酸、甲酸（均為色譜純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

1290B型高效液相色譜、G6490A三重四極桿質(zhì)譜儀美國Agilent公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；Milli-Q超純水制備機 美國Millipore公司；氮吹濃縮儀 美國Organomation Associates公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

由市場上直接購買活鯉魚，從中隨機取樣，檢測確認(rèn)為陰性樣品后進(jìn)行飼養(yǎng)。在室溫環(huán)境下養(yǎng)殖2 d 后，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的藥物含量，向魚池中添加氟苯尼考，實時監(jiān)控檢測水體中和魚體內(nèi)的氟苯尼考含量，氟苯尼考在魚體內(nèi)的含量不斷富集增高，當(dāng)魚肉中的氟苯尼考含量達(dá)到預(yù)設(shè)含量時，將鯉魚捕撈至不含藥物的池中繼續(xù)養(yǎng)殖1 d 后捕撈。

將鯉魚宰殺，洗去血水取肌肉部分，混合攪碎制成魚糜，－70 ℃真空冷凍干燥。將冷凍干燥的魚糜粉碎后研磨過篩，用聚乙烯瓶分裝，加貼唯一性標(biāo)識，常溫保存，每個瓶內(nèi)樣品質(zhì)量約4.0 g，共768 瓶。以備進(jìn)一步做均勻性和穩(wěn)定性檢測［3］。

1.3.2樣品前處理

依據(jù)GB/T 22959—2008《河豚魚、鰻魚和烤鰻中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，稱?。?.00±0.01）g魚粉樣品，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入4.0 mL純水浸泡過夜。加入25 mL乙酸乙酯和0.75 mL氨水，超聲波混合5 min，5 000 r/min離心5 min，移取上層乙酸乙酯至25.0 mL雞心瓶中，向殘渣中再加20 mL乙酸乙酯和0.60 mL氨水，振蕩混合5 min，5 000 r/min離心5 min，合并上層乙酸乙酯相，40 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，氮氣吹干。加入1 mL流動相（V（甲醇）∶V（水）=60∶40）定容，振蕩混合30 s，加入2 mL正己烷，振蕩1 min，除去上層正己烷，再加入2 mL正己烷，振蕩1 min，取下層水相5 000 r/min離心5 min，溶液過濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3液相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；流動相A為水，流動相B為甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.1 min，10% B；0.1～4.0 min，10%～95% B；4.0～5.0 min，10% B；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測，電子倍增管電壓：350 V；霧化氣壓力：20 psi；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：3 000 V；定量離子對m/z 356/185；定性離子對m/z 356/336。

1.3.4均勻性檢驗

從制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機抽取15 個獨立包裝，每個樣品重復(fù)測試3 次，分析樣品中氟苯尼考的含量。所有的樣品以隨機次序在重復(fù)性條件下測試，按照上述檢測方法對樣品進(jìn)行均勻性檢測，檢測數(shù)據(jù)用單因素方差分析法來判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品是否均勻［4］。

1.3.5穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的關(guān)鍵，本實驗同時考察了魚肉凍干粉氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性［5-8］。

標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性研究的基本模型是Y=β0+β1X+ε，用線性擬合模型評估標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性，以x代表時間，y代表標(biāo)準(zhǔn)樣品中氟苯尼考的含量，斜率b1用式（1）計算［17］：

截距b0用式（2）計算［17］：

與斜率相關(guān)的不確定度Sb1用式（3）計算［17］：

在95%的置信水平，t臨界值用t0.95（n－2）表示，當(dāng)|b1|＜t0.95（n－2）·Sb1，表明標(biāo)準(zhǔn)樣品是穩(wěn)定的。

1.3.5.1短期穩(wěn)定性檢驗

短期穩(wěn)定性實驗進(jìn)行30 d，按先密后疏選0、2、5、9、14、30 d 6 個時間點，隨機取18 瓶放于（40±2） ℃保存，模擬運輸中遇到的極端溫度，每次測量隨機選擇3 瓶，平行測定2 次，進(jìn)行樣品的短期穩(wěn)定性分析。

1.3.5.2長期穩(wěn)定性檢驗

將樣品的存放溫度設(shè)定為（－20±2） ℃，長期穩(wěn)定性實驗時間為24 個月，選6 個時間點0、3、6、12、18、24 月，每次測量隨機選擇3 瓶，平行測定2 次，進(jìn)行樣品的長期穩(wěn)定性分析。

1.3.6定值分析

參照CNAS—CL04：2007《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》［9］第二部分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值-通用原則和統(tǒng)計原理，標(biāo)準(zhǔn)樣品由多個實驗室采用多種方法進(jìn)行定值，本研究選擇8 家氟苯尼考檢測能力得到中國國家合格評定委員會認(rèn)可的實驗室進(jìn)行協(xié)作定值，每個實驗室發(fā)3 個樣品，每個樣品獨立測定2 次，定值方法為實驗室認(rèn)可的檢測方法［10-12］。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品譜圖

按前述分析方法處理樣品后，得到的選擇離子監(jiān)測色譜圖（10 μg/kg）如圖1所示。由圖1可見，氟苯尼考的響應(yīng)值良好，標(biāo)準(zhǔn)魚肉樣品中氟苯尼考的殘留量是適當(dāng)?shù)摹?/p>

圖1　魚肉中氟苯尼考的總離子圖Fig.1　Total iron chromatograms of florfenicol in fish

2.2均勻性檢測結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性應(yīng)當(dāng)均勻，即在規(guī)定的細(xì)分范圍內(nèi)保證其特性不變。在均勻性檢驗過程中，一般需同時考察組間均勻性及組內(nèi)均勻性［13-16］，用方差分析法通過對兩者的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。均勻性檢驗結(jié)果如表1、2所示。

表1　氟本尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性檢驗（n=3）Table1　Homogeneity test of florfenicol reference material （n= 3）

表2　氟本尼考樣品均勻性檢驗的單因素方差分析結(jié)果Table2　Results of one-way analysis of variance for florfenicol homogeneityneity

根據(jù)方差分析原理，該統(tǒng)計量是自由度為（v1，v2）的F分布變量。由公式v1=m－1，v2=N－m，并已知m=15，N=3×15=45；則v1=14，v2=30，F(xiàn)=1.672＜F0.05（14，30）=2.037，故該樣品組內(nèi)及組間無顯著性差異，樣品均勻性良好，能滿足實驗要求。

2.3穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.3.1短期穩(wěn)定性

表3　氟本尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品短期穩(wěn)定性檢驗（n=6）Table3　Short-term stability test of florfenicol reference material （ n= 6）

表3是6 個時間點測得的氟苯尼考含量的數(shù)據(jù)及平均值，線性擬合模型分析結(jié)果見表4，從表4可以看出，表明氟苯尼考在（40±2）℃極端運輸條件下30 d內(nèi)無明顯的降解趨勢，未觀測到不穩(wěn)定性。

表4　氟本尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table4　Linear model for short-term stability of florfenicol reference material

2.3.2長期穩(wěn)定性

表5是6 個時間點測得的氟苯尼考含量的數(shù)據(jù)及平均值，線性擬合模型分析結(jié)果見表6，通過分析可得出故斜率是不顯著的，表明氟苯尼考在（－20±2）℃條件下24 個月內(nèi)未觀測到不穩(wěn)定性。

表5　氟本尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)Table5　Long-term stability test of florfenicol reference material

表6　氟本尼考樣品長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的分析結(jié)果Table6　Linear model for long-term stability of florfenicol reference material

從實驗結(jié)果可以看出，魚肉凍干粉氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性都很良好，完全符合標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。

2.4定值

8 個認(rèn)可實驗室均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，參加協(xié)同定值數(shù)據(jù)及處理結(jié)果見表7。

表7　各定值實驗室的氟苯尼考測定數(shù)據(jù)（n=6）Table7　Analytical data for florfenicol obtained by different accredited laboratories （n= 6）

將每個實驗室的數(shù)據(jù) 先用Grubb's法進(jìn)行檢驗，無異常值；匯總各實驗室數(shù)據(jù)，將所有的數(shù)據(jù)按大小順序排列，進(jìn)行夏皮羅-威克爾檢驗，公式見式（4）［17］

經(jīng)計算W=0.959，當(dāng)n=48時，P=0.947，W＞P，表明在顯著性水平α=0.05上符合正態(tài)分布。再將每個實驗室的平均值組成一組數(shù)據(jù)，用Grubb's法進(jìn)行雙側(cè)情形檢驗，確定各實驗室數(shù)據(jù)無異常值；將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步統(tǒng)計，用Cochran檢驗以確定8 個實驗室中沒有隨機誤差太大的實驗室，公式見式（5）［17］：

式中：si為各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；smax為si中的最大值。

顯著性水平α=0.05，測定組數(shù)為8，每組測定6 次，計算C值，與Cochran檢驗臨界值C0.05（8，6）比較，經(jīng)檢驗，C=0.278 8，C0.05（8，6）=0.36，C＜C0.05（8，6），表明各實驗室間的測量屬于等精度測量，匯總所有數(shù)據(jù)，計算總平均值為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品含量定值結(jié)果：10.17 μg/kg。

2.5不確定度評估

本標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度來源主要有以下幾個方面［18-23］：標(biāo)準(zhǔn)樣品的不均勻性引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)樣品的不穩(wěn)定性引入的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)樣品定值過程中引入的不確定度?？紤]到氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品在室溫條件下有較好的穩(wěn)定性，該保存條件在運輸中比較容易實現(xiàn)，因此在合成不確定度中可以不考慮短期穩(wěn)定性不確定度分量。

由標(biāo)準(zhǔn)樣品不均勻性引入的不確定度，見表2，當(dāng)組間均方MSamong＞組內(nèi)均方MSwithin，不均勻性不確定度［17］ubb=Sbb。

由標(biāo)準(zhǔn)樣品不穩(wěn)定性引入的不確定度，設(shè)長期穩(wěn)定性保質(zhì)期t為24 個月，則由長期不穩(wěn)定性帶來的不確定度貢獻(xiàn)為：ults=Sb·t=0.009 65×24=0.231 6 μg/kg。

由定值引入的標(biāo)準(zhǔn)樣品不確定度［17］為：

經(jīng)計算，uchar=0.134 5 μg/kg。

標(biāo)準(zhǔn)樣品的合成不確定度［17］公式為：

經(jīng)計算，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品的各項不確定度如表8所示。

表8　氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度Table8　Uncertainty of florfenicol reference material

設(shè)置信水平為P=99%，包含因子k=3，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為（10.17±0.93）μg/kg。

3　結(jié) 論

通過添加氟苯尼考養(yǎng)殖鯉魚獲得樣品基質(zhì)，制備的樣品與日常檢測樣品相一致，在均勻性和穩(wěn)定性均滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品要求的前提下，通過8 家實驗室協(xié)作定值的方式對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值和不確定度評估，定值結(jié)果通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源，同時制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性可達(dá)到36 個月，滿足水產(chǎn)品中氟苯尼考?xì)埩魴z測質(zhì)量控制和相關(guān)的科研需要。本研究樣品制備方式和標(biāo)準(zhǔn)樣品定值方法的建立，對其他獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備具有參考意義，對于建立食品獸藥殘留干粉標(biāo)準(zhǔn)樣品的國家標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

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Preparation of Reference Material for the Determination of Florfenicol in Fish

YANG Lijun1， LIANG Junni2， CAO Peng2， GUAN Lili2
（1. Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weihai 264200， China；2. Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yantai 264000， China）

A method for preparing florfenicol reference material （RM） from the muscle of common carp fish exposed to aqueous florfenicol when alive was investigated. The homogeneity and stability of the prepared sample were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The certified value for florfenicol was based on analysis of results obtained in 8 accredited laboratories and uncertainty evaluation was conducted. The results showed that the reference material had a good homogeneity and stability within 36 months， and could be used for the determination of florfenicol residue in aquatic products.

reference material； florfenicol； homogeneity； stability； uncertainty

O657

A

1002-6630（2015）14-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201514034

2014-09-11

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B01）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201310143）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2013IK178）

楊麗君（1969—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品檢測。E-mail：18663136117@163.com