楊森 李薇 方媛 任朝君

摘 要：硫酸鏈霉素生產(chǎn)使用灰色鏈霉菌（Streptomyces Griseus），此次實驗過程中是以四級發(fā)酵為基本工藝生物合成鏈霉素。在此次發(fā)酵實驗中，主要對四級種子的發(fā)酵時間工藝選擇，以及控制發(fā)酵罐pH值、溶氧條件控制這些發(fā)酵過程中關(guān)鍵性因素進行了一系列的生物發(fā)酵實驗的探索，以實際生物發(fā)酵數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，最大化的提高鏈霉素的發(fā)酵單位，革新硫酸鏈霉素的發(fā)酵工藝。

關(guān)鍵詞：硫酸鏈霉素；工藝創(chuàng)新

鏈霉素是1944年發(fā)現(xiàn)的一種氨基糖苷類藥物，用于治療結(jié)核病的有效抗生素。作為一種老的抗生素，鏈霉素不僅是治療結(jié)核病的主要藥物，而且在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用也越來越廣泛。鏈霉素作為工業(yè)化發(fā)酵工藝，其影響發(fā)酵單位的因素是相當(dāng)復(fù)雜的；在抗生素發(fā)酵過程中，影響菌體生產(chǎn)和產(chǎn)物形成的因素很多，各參數(shù)之間相互關(guān)聯(lián)，變化其中某一個參數(shù)，常會引起其他參數(shù)的變化。在實際工業(yè)中，積累了大量過程生產(chǎn)數(shù)據(jù)，大多數(shù)情況下是棄之不用的。這主要是因為這些數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)程度高，很難從表面上判斷過程特點和規(guī)律，從而指導(dǎo)實踐生產(chǎn)[1]。并且，其營養(yǎng)物質(zhì)的來源、空氣質(zhì)量、pH、溶氧條件、攪拌等因素都直接或者間接的影響著菌絲生物發(fā)酵的過程；為此，我們在實驗中經(jīng)過大量的實驗和數(shù)據(jù)對比，首先，確定了最佳種子培養(yǎng)的周期，使其發(fā)酵過程前期避免了氨氮消耗過快影響發(fā)酵單位的增長；其次，細化和革新pH與溶氧條件，優(yōu)化了鏈霉素的生長和代謝環(huán)境使其始終處在一個次級代謝旺盛的發(fā)酵階段。

材料與方法

1 材料

1.1 菌種 硫酸鏈霉素灰色鏈霉菌由華北制藥華勝公司提供。

1.2 發(fā)酵種子工藝對營養(yǎng)物質(zhì)的選擇

初級子種培養(yǎng)基：葡萄糖、黃豆粉、硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿、消后體積300L，消前pH自然，30℃培養(yǎng)。

中級增速培養(yǎng)基：葡萄糖、黃豆粉、硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿，消后體積2m3，消前pH自然，30℃培養(yǎng)。

三級放大培養(yǎng)基：葡萄糖、黃豆粉、硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿，消后體積6m3，消前pH值調(diào)至6.0以上，30℃培養(yǎng)

發(fā)酵罐營養(yǎng)培養(yǎng)基：低溫餅粉、硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸二氫鉀、玉米漿、配置體積42m3，消前pH值調(diào)制pH6.5-6.8。

1.3 三級種子周期對發(fā)酵前期單位的影響

從鏈霉菌代謝和產(chǎn)生鏈霉素的機理上分析，絲狀菌深層培養(yǎng)時，主要的繁殖方式是借菌絲斷片來形成新菌絲體；效價的高低和增長幅度可以表證菌絲的生長代謝階段，也可以反映種子菌絲的質(zhì)量。所以，種子罐效價，尤其是三級（末級）種子罐效價與發(fā)酵罐水平具有較強的相關(guān)性。移種時機在發(fā)酵過程控制中的重要性。應(yīng)選擇對數(shù)生長末期，即將進入分化的相對年輕的菌絲作為種子，其表觀物理特征是菌絲量最大；由此，我們將發(fā)酵種子周期經(jīng)行了細化分析：

表1 四級發(fā)酵種子周期對應(yīng)發(fā)酵前期單位

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][初級

24h

22h

22h

24h

20h

18h

26h][中級

24h

22h

24h

24h

22h

22h

26h][三級

24h

28h

26h

28h

28h

28h

20h][三級種子放罐單位

890

990

850

1000

998

790

460][發(fā)酵罐40小時單位

2350

3100

2460

3089

3102

2209

1550]

從表中分析可以得出，對于初級與中級種子培養(yǎng)，其目的是菌絲生長的初級階段，其培養(yǎng)周期在20-24小時為最佳；而從表中可以看出，三級種子的發(fā)酵末端，為其對數(shù)生長期，在對數(shù)生長期接種會改善了種子液質(zhì)量，增強了發(fā)酵能力，提高發(fā)酵單位。

由此，我們根據(jù)種子罐的代謝階段調(diào)節(jié)三級種子罐的培養(yǎng)時間，考慮到生產(chǎn)效能，前兩級種子罐合理的移種周期應(yīng)該在20小時，三級種子在28小時接種，這樣可以避免糖、氮過度消耗使菌絲老化，已達到經(jīng)濟和工藝效益的最大化。

1.4 發(fā)酵過程控制工藝對發(fā)酵單位的影響

通過生產(chǎn)批記錄數(shù)據(jù)分析新思路的引入，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵pH值是影響發(fā)酵單位的顯著因素；由于葡萄糖作為硫酸鏈霉素的一個重要前體物質(zhì)，我們大膽提出pH+溶氧調(diào)控理念，通過調(diào)整pH值和溶氧條件來控制發(fā)酵過程對葡萄糖的代謝比，以期達到提高發(fā)酵單位的目的。

控制發(fā)酵過程中最適pH與溶氧值。在實驗過程中，我們利用在線pH電極和發(fā)酵自動控制系統(tǒng)，通過補料系統(tǒng)補加氨水，閉環(huán)控制使硫酸鏈霉素發(fā)酵過程中處于我們設(shè)定的pH值，做到發(fā)酵過程pH的穩(wěn)定。并且，我們通過安裝在發(fā)酵罐中的溶氧電極，時時測定發(fā)酵過程中的溶氧參數(shù)，以控制攪拌的轉(zhuǎn)動頻率來控制發(fā)酵過程中的溶氧參數(shù)，下表為實驗過程中的發(fā)酵數(shù)據(jù)：

表2 發(fā)酵過程周期單位對應(yīng)pH值和溶氧值

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][周期

24h

48h

72h

96h

120h

144h

168h

192h

發(fā)酵放罐單位][pH自控值

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

6.0-7.0

24679][pH自控值

6.0-6.5

6.2-6.5

6.5-6.6

6.5-6.7

6.7-6.9

6.7-6.9

6.9-7.0

7.0-7.2

28215][攪拌全程工頻

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

65Hz

26503][根據(jù)溶氧按需供應(yīng)

25Hz

30Hz

45Hz

40Hz

55Hz

60Hz

65Hz

65Hz

26612]

在此次實驗過程中，pH單項實驗的攪拌功率都是工頻；攪拌單項實驗的pH值是按pH值全程6.0-7.2；從上表中可以看出，鏈霉素在發(fā)酵過程中并不需要全程攪拌全開；按照溶氧電極顯示的數(shù)據(jù)經(jīng)行按需開攪拌能在不影響發(fā)酵單位的前提下有效節(jié)約能源；在pH自控值的探索中，我們經(jīng)過大量實驗確定了各個時間點的對應(yīng)pH值數(shù)據(jù)；是其菌絲一直處在利于發(fā)酵代謝的環(huán)境當(dāng)中。

2 結(jié)論

通過此次實驗和數(shù)據(jù)總結(jié)，我們確定了硫酸鏈霉素發(fā)酵種子培養(yǎng)最佳周期，使其能在對數(shù)生長期的最佳時刻接種；并且利用pH電極和溶氧電極創(chuàng)新了鏈霉素的發(fā)酵工藝，細化了發(fā)酵工程，提高了發(fā)酵水平。

參考文獻：

[1]陳元青，陳琦，王樹青，等.多元統(tǒng)計分析方法在鏈霉素發(fā)酵中的應(yīng)用[J].生物工程報，1999，15（3）：368-372.

作者簡介：楊森（1986-），男，河北邯鄲人，任職于華北制藥股份有限公司新制劑分廠，職稱：醫(yī)藥工程助理工程師學(xué)士學(xué)位，研究方向：發(fā)酵工程與工藝。