劉海英,范劉士博
(1.唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,河北 唐山 063000;2.天津市寶坻區(qū)第四中學(xué),天津 301800)
杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的保護(hù)作用
劉海英1,范劉士博2
(1.唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,河北 唐山 063000;2.天津市寶坻區(qū)第四中學(xué),天津 301800)
目的:分析杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的保護(hù)能力和對(duì)化療效果的影響。方法:將小鼠隨機(jī)分為6 組:空白對(duì)照組(A組)、用糖對(duì)照組(B組)、腫瘤模型組(C組)、化療組(D組)、感染用糖組(E組)和化療用糖組(F組)。其中“用糖”是指在40 d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)一直腹腔注射100 mg/(kg·d)(以體質(zhì)量計(jì),下同)杏鮑菇多糖,“感染”是指在實(shí)驗(yàn)第1天一次性后肢皮下注射3 mL/kg新鮮制備的含有S180腫瘤細(xì)胞的種鼠腹水;“化療”是指小鼠接種S180細(xì)胞10 d后腹腔注射5.0 mg/kg順鉑,間隔1 d注射一次,共注射5 次。接種20~40 d時(shí)觀測(cè)死亡率、體質(zhì)量、白細(xì)胞數(shù)量和腹水超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度。結(jié)果:杏鮑菇多糖能夠顯著降低S180荷瘤小鼠的死亡率,延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間,增加血液內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)腹水SOD和CAT的酶活性,降低MDA濃度,降低化療對(duì)小鼠免疫能力的影響(P<0.05)。結(jié)論:杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠具有極強(qiáng)的保護(hù)作用,并且能夠降低順鉑化療的副作用。
杏鮑菇多糖;S180腫瘤細(xì)胞;化療;保護(hù)作用
目前,真菌多糖抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用受到越來(lái)越多的重視。例如,靈芝多糖已成為臨床治療腫瘤的輔助藥物,香菇多糖(lentinanum)已被制成抗癌針劑,用于胃腸道腫瘤患者的治療[1]。真菌多糖雖然不能殺死腫瘤細(xì)胞,但能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力,抑制腫瘤細(xì)胞的增生,激活免疫細(xì)胞,吞噬、清除老化細(xì)胞和異物[2]。杏鮑菇是一種集食用、藥用于一體的名貴珍稀食用菌,杏鮑菇多糖是其主要的活性物質(zhì),具有降血脂、降膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、促進(jìn)胃腸消化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和美容的功效[3-4]。杏鮑菇多糖具有較強(qiáng)的清除羥自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和NO2-自由基能力[5]的體外抗氧化活性[6-7],還具有抗疲勞、提高老齡小鼠的運(yùn)動(dòng)能力[8]、對(duì)白色鏈球菌和產(chǎn)氣桿菌的抑菌作用[9],而且抑制Ⅰ型單純皰疹病毒的作用強(qiáng)度與阿昔洛韋相當(dāng)[10]。遲桂榮等[11]發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多糖具有一定的抑瘤作用,本研究在此基礎(chǔ)上,系統(tǒng)分析了杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的保護(hù)作用,同時(shí)觀測(cè)了杏鮑菇多糖與順鉑化療協(xié)同作用的抑瘤效果,為杏鮑菇多糖的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1材料、動(dòng)物與試劑
杏鮑菇:PL7菌株,購(gòu)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院。
小鼠:清潔型,雄性,7 周齡,體質(zhì)量(18.2± 1.62) g,購(gòu)于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證編號(hào):08048,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(冀)2004-0038。S180(小鼠腹水型肝癌)細(xì)胞:用注射器取接種S180細(xì)胞7 d種鼠的腹水1.0 mL,以無(wú)菌生理鹽水稀釋后,用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè),制成腫瘤細(xì)胞懸液(活細(xì)胞率>95%),使用前新鮮制備。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)試盒(A001-1,羥胺法)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)測(cè)試盒(A007-2,紫外分光光度法)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)試盒(A003-1,硫代巴比妥酸比色法) 南京建成生物工程研究所。順鉑(cisplatin) 錦州九泰藥業(yè)公司。
1.2儀器與設(shè)備
752N紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;YX-280高壓蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;TGL-16GR多用途臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金金壇市醫(yī)療器廠;AdventurerTM精密分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;奧林巴斯CX41光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯(中國(guó))有限公司。
1.3方法
1.3.1杏鮑菇多糖的提取和質(zhì)量濃度測(cè)定
利用熱水浸提法提取杏鮑菇菌絲多糖[12],利用Sevag方法[13]去除蛋白質(zhì),利用茚三酮反應(yīng)檢測(cè)蛋白質(zhì),利用蒽酮比色法[14]制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,按劉海英等[15]的方法測(cè)定菌絲多糖的質(zhì)量濃度。
1.3.2動(dòng)物分組及處理
清潔型小鼠基礎(chǔ)飼料預(yù)飼養(yǎng)7 d,稱質(zhì)量并編號(hào),選取60 只體形一致、毛色相同、精神狀態(tài)飽滿的小鼠,按10 只/組隨機(jī)分為6 組:空白對(duì)照組(A組)、用糖對(duì)照組(B組)、腫瘤模型組(C組)、化療組(D組)、感染用糖組(E組)和化療用糖組(F組)。均飼喂相同批次基礎(chǔ)飼料。
A組按100 mL/(kg?d)的劑量(以體質(zhì)量計(jì),下同)腹腔注射生理鹽水;B組:按100 mg/(kg?d)的劑量腹腔注射杏鮑菇多糖;C組:在實(shí)驗(yàn)第1天按0.2 mL/只的劑量一次性在小鼠后肢皮下注射新鮮制備的S180腫瘤細(xì)胞懸浮液;D組:同C組,注射S180細(xì)胞10 d后腹腔注射5.0 mg/kg順鉑,間隔1 d注射一次,共注射5 次;E組:同C組,注射S180細(xì)胞后第2天按100 mg/(kg?d)的劑量腹腔注射杏鮑菇多糖;F組:同C組,注射S180腫瘤細(xì)胞后第2天按100 mg/(kg?d)的劑量腹腔注射杏鮑菇多糖,并在10 d后腹腔注射5.0 mg/kg順鉑,間隔1 d注射一次,共注射5 次。
1.3.3生理指標(biāo)分析
接種S180細(xì)胞40 d時(shí),統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活率、平均存活時(shí)間和生存延長(zhǎng)率;接種S180細(xì)胞20 d時(shí),用注射器抽取小鼠腹水1 mL/只,2 000 r/min離心取上清液,測(cè)定SOD活性、CAT活性及MDA含量;接種S180細(xì)胞20 d時(shí),試管內(nèi)放體積分?jǐn)?shù)1%的稀鹽酸1.98 mL,斷尾,毛細(xì)管取血20 ?L加入稀鹽酸內(nèi),消去紅細(xì)胞,用血球計(jì)數(shù)板在40倍鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)白細(xì)胞數(shù)量;接種S180細(xì)胞40 d內(nèi),用分析天平稱量死亡24 h以內(nèi)小鼠和最后存活小鼠的體質(zhì)量,剝離腫瘤,電子天平稱量腫瘤質(zhì)量。按照以下公式計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理
所有數(shù)據(jù)采用DPS 7.05 進(jìn)行方差分析和多重比較,數(shù)據(jù)以表示。
2.1杏鮑菇多糖的提取和濃度測(cè)定結(jié)果
利用熱水浸提法提取到的杏鮑菇菌絲多糖,經(jīng)過(guò)Sevag方法去除蛋白質(zhì)后,茚三酮反應(yīng)檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。利用蒽酮比色法獲得了葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.01x-0.022 2(R2=0.992 3)。將PL7菌株的菌絲多糖用無(wú)菌水配制100 μg/mL溶液,按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定其菌絲多糖質(zhì)量濃度為(3.699±0.230)mg/g。
2.2杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠存活率的影響
表1 杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響Table1 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on survival time of S180-bearing mice
由表1可知,A組和B組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間都表現(xiàn)為健康正常。C組小鼠接種S180細(xì)胞5 d后有小鼠可觸及腫瘤,10 d內(nèi)小鼠成瘤率100%。成瘤后小鼠飲食減少,活動(dòng)減少或很少活動(dòng),毛發(fā)雜亂無(wú)光澤,豎毛現(xiàn)象明顯。16 d后開始出現(xiàn)小鼠死亡,24 d內(nèi)所有小鼠死亡,平均存活時(shí)間為(20.9±2.5) d。
D組小鼠10 d內(nèi)成瘤率100%,注射順鉑后小鼠的活動(dòng)能力有所增強(qiáng),進(jìn)食略有增加,豎毛現(xiàn)象略有減少,但毛色依然無(wú)光澤,且有脫毛現(xiàn)象。21 d后小鼠開始出現(xiàn)死亡,33 d內(nèi)小鼠全部死亡,平均存活時(shí)間(28.8±3.7) d。
E組小鼠10 d內(nèi)成瘤率50%,20 d時(shí)成瘤率80%,30 d時(shí)成瘤率100%。小鼠活潑,皮毛有光澤,豎毛現(xiàn)象不明顯。27 d后小鼠開始出現(xiàn)死亡,40 d內(nèi)小鼠存活率20%,平均存活時(shí)間(36.8±2.1) d。
F組小鼠31 d時(shí)成瘤率100%。小鼠活潑,皮毛有光澤,豎毛現(xiàn)象和脫毛現(xiàn)象都不明顯。29 d后小鼠開始出現(xiàn)死亡,40 d內(nèi)小鼠存活率30%,平均存活時(shí)間(37.6±1.4) d。以B組為對(duì)照,E組和F組的生存延長(zhǎng)率分別為76.1%和79.9%。
2.3杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠體質(zhì)量和抑瘤率的影響
表2 杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠體質(zhì)量和抑瘤率的影響Table2 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on body weight and tumor size of S180-bearing mice
由表2可知,與A組小鼠相比,B組小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有顯著變化,而C組荷瘤小鼠由于腫瘤的生長(zhǎng)速率快,加速了小鼠的死亡,使C組小鼠的平均體質(zhì)量沒(méi)有下降,反而有所增加,比A組體質(zhì)量提高了21.90%。 D組化療小鼠體質(zhì)量增加與C組荷瘤小鼠相比較為緩慢,體質(zhì)量平均增加15.39%。E組和F組經(jīng)杏鮑菇多糖處理,使得荷瘤小鼠和化療小鼠的體質(zhì)量分別下降11.25%和12.92%,其主要原因是顯著抑制了腫瘤的發(fā)展,實(shí)體瘤質(zhì)量顯著降低,對(duì)荷瘤小鼠和化療小鼠的抑瘤率分別達(dá)到69.43%和72.43%,顯著高于D組順鉑化療的抑瘤率(29.72%)。
2.4杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響
圖1 杏鮑菇多糖對(duì)荷瘤小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.1 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on the number of blood leucocytes in S180-bearing mice
接種S180細(xì)胞20 d時(shí)測(cè)定小鼠白細(xì)胞數(shù)量,各處理組的白細(xì)胞濃度見圖1。A~F組小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量分別為(12.17±0.50)×109、(15.54±0.49)×109、(9.16±0.68)×109、(8.36±0.67)×109、(14.03±0.91)×109、(14.89±1.04)×109個(gè)/L,與A組小鼠相比,C組荷瘤小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量下降了24.7%,形狀不規(guī)則。D組小鼠化療后白細(xì)胞數(shù)量比A組正常小鼠下降了31.3%,比C組荷瘤小鼠下降了8.7%。杏鮑菇多糖處理后,B組正常小鼠、E組荷瘤小鼠和F組化療小鼠的白細(xì)胞數(shù)量都顯著增加,增加幅度分別達(dá)到27.67%(以A組為對(duì)照)、53.17%(以C組為對(duì)照)和78.11%(以D組為對(duì)照),并且細(xì)胞形態(tài)正常、規(guī)則。
2.5杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腹水酶活性及丙二醛含量的影響
接種S180細(xì)胞20 d時(shí)測(cè)定小鼠腹水酶SOD和CAT活性、丙二醛含量,由表3可知,與A組正常小鼠相比,C組荷瘤小鼠腹水酶SOD和CAT的活力分別下降26.77%和26.33%,MDA含量上升36.89%;D組化療小鼠腹水酶SOD和CAT的活力分別下降26.52%和26.53%,MDA含量上升29.92%。注射杏鮑菇多糖后,B組正常小鼠、E組荷瘤小鼠和F組化療小鼠腹水酶SOD和CAT的活性均顯著增強(qiáng),MDA含量顯著降低,其中SOD活力分別增加41.33%(以A組為對(duì)照)、63.28%和5 3.86%(以C組為對(duì)照),CAT活力分別增加131.54%(以A組為對(duì)照)、145.00%和159.18%(以C組為對(duì)照),MDA含量分別降低3.58%(以A組為對(duì)照)、26.61%和20.14%(以C組為對(duì)照)。杏鮑菇多糖對(duì)CAT的酶活性具有非常顯著的刺激作用,可提高S180荷瘤小鼠CAT酶活力1.5 倍左右。
表3 杏鮑菇多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腹水酶活性及丙二醛濃度的影響Table3 Effects of Pleurotus eryngii polysaccharides on the activities of SOD and CAT and MDA content in the ascites of S180-bearing mice
Shamtsyan等[16]研究表明,菌絲體多糖具有比子實(shí)體多糖更強(qiáng)的生物學(xué)活性,作用的活性氧形式更多,外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加程度更大,促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的濃度范圍更寬,更易刺激外周血細(xì)胞中白細(xì)胞介素(interleukine)的產(chǎn)生,對(duì)移植小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率和存活率更高。另外,子實(shí)體多糖的產(chǎn)量和質(zhì)量極易受到食用菌生產(chǎn)周期和子實(shí)體質(zhì)量的影響,難以標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?;a(chǎn)。而采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體,周期短、成本低、產(chǎn)量大,多糖制備容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化,多糖質(zhì)量容易得到控制,因此非常適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)采用杏鮑菇菌絲多糖進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)更有利于杏鮑菇多糖的開發(fā)和利用。
本研究結(jié)果表明,杏鮑菇菌株P(guān)L7的菌絲多糖能夠顯著提高荷瘤小鼠的生存率,抑制腫瘤的發(fā)展,抑瘤效果與黑木耳多糖[18]、香菇多糖[18-20]、榆黃菇多糖[21]、靈芝多糖[22]相似。杏鮑菇PL7多糖還可以增加血液中的白細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)腹水酶SOD和CAT的活性,降低MDA含量,尤其在增強(qiáng)CAT酶活性方面表現(xiàn)更突出,可提高荷瘤小鼠CAT酶活性1.5 倍。這與前期研究中發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多糖具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的[5-7]。
順鉑是臨床應(yīng)用比較廣泛的一種抗癌藥物,主要作用機(jī)制是通過(guò)損傷DNA,使細(xì)胞進(jìn)入G1期生長(zhǎng)受到抑制,并誘導(dǎo)損傷嚴(yán)重的細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[23]。順鉑的副作用較大,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)傷害正常細(xì)胞,尤其是免疫細(xì)胞。添加食用菌多糖是降低順鉑化療的副作用和增強(qiáng)化療效果的有效途徑之一。香菇多糖輔助順鉑化學(xué)治療肺癌[24]、卵巢癌[25]、晚期胃癌[26],靈芝多糖輔助順鉑化學(xué)治療膀胱癌[27],灰樹花多糖聯(lián)合順鉑治療肝癌[28]等均有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,杏鮑菇PL7多糖能夠顯著增加化療小鼠的白細(xì)胞數(shù)目,增強(qiáng)化療小鼠的腹水酶SOD和CAT活性,從而降低化療過(guò)程中產(chǎn)生的副作用,化療小鼠的生存率和抑瘤率得到顯著提高。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用杏鮑菇多糖輔助化療方法比單獨(dú)化療和單獨(dú)多糖處理時(shí),血液中白細(xì)胞增加的數(shù)目更多,荷瘤小鼠的生存延長(zhǎng)率和抑瘤率更高,抑瘤效果更顯著,具有一定的臨床應(yīng)用前景。
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Protective Effects of Pleurotus eryngii Polysaccharides on S180 Tumor-Bearing Mice
LIU Haiying1, FAN Liushibo2
(1. Agricultural Institute of Tangshan, Tangshan 063000, China; 2. Tianjin Baodi No.4 High School, Tianjin 301800, China)
Objective: This study aimed to examine the protective effects of Pleurotus eryngii polysaccharides (PePs) on mice bearing sarcoma 180 (S180) cells and the efficacy of PePs in reducing the side-effects of chemotherapy with cisplatin. Methods: Healthy male mice were randomly divided into blank control group (A), PePs treatment group (B), model blank group (C), chemotherapy group (D), Peps treatment group (E) and Pep treatment plus chemotherapy group (F). PePs were intraperitoneally injected at a dose of 100 mg/(kg?d) body weight (bw) daily for 40 days. A single dose of ascites fluid(3 mL/kg bw) from mice inoculated with S180 was subcutaneously injected on the first day of experiment. Chemotherapy was achieved by five repeated intraperitoneal injections of 5.0 mg/kg bw of cisplatin every other day from 10 days after administration of S180 cells. During 20-40 days after inoculation of S180 cells, the death rate, body weight, blood leucocyte number, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, malondialdehyde (MDA) concentration in the ascites fluid of mice were measured. Results: The fungal polysaccharides significantly reduced the mortality rate of S180-bearingmice, prolonged the survival time, increased the number of blood leucocytes, enhanced the activities of ascites SOD and CAT enzymes, decreased the ascites MDA concentration, and reduced the adverse effects of chemotherapy on mouse immunity (P < 0.05). Conclusion: PePs possess strong protective effects on S180-bearing mice and reduce the side effects of cisplatin chemotherapy.
Pleurotus eryngii polysaccharides; sarcoma 180 (S180) cells; chemotherapy; protective effect
R151.3
A
1002-6630(2015)03-0198-04
10.7506/spkx1002-6630-201503038
2014-05-08
河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10220126)
劉海英(1968—),女,副研究員,本科,研究方向?yàn)槭秤镁?。E-mail:lhy688@126.com