魏維偉, 楊華武, 孔 波

(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，湖南長(zhǎng)沙 410014)

煙用料液和煙用表香香精一樣，在改善卷煙吸味方面有著重要的作用。表香香精的指紋圖譜相對(duì)容易獲得，且其色譜有較高的信息量和較好的重現(xiàn)性。而煙用料液的指紋圖譜則因其水溶性成分較難提取，造成指紋圖譜信息量有限、特征反映不顯著、重現(xiàn)性差。因此，煙用料液的指紋圖譜技術(shù)亟待改進(jìn)以正確表征其質(zhì)量狀態(tài)或質(zhì)量特點(diǎn)。目前，煙用料液分析主要集中在非揮發(fā)的成分分析[1,2]，如糖類、氨基酸、類胡蘿卜素等的測(cè)定[3]。煙用料液的指紋圖譜方法主要是液相色譜法和有機(jī)溶劑液-液萃取的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)。液相色譜法存在無(wú)通用檢測(cè)器、檢測(cè)靈敏度低、分離效果低的缺點(diǎn)。有機(jī)溶劑液-液萃取的GC-MS則因有機(jī)溶劑為非極性或弱極性，僅能萃取煙用料液中的非極性和弱極性組分、無(wú)法有效萃取煙用料液中的水溶性成分，所以其指紋圖譜信息量有限、水溶性成分特征反映不顯著、重現(xiàn)性差。用弱極性的二氯甲烷、乙醚等替代非極性的正己烷有助于改善這些缺陷，但改善程度有限。

固相微萃取(SPME)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的新型樣品預(yù)處理方法[4]，具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)[5,6]，已經(jīng)應(yīng)用于煙用香精香料的分析檢測(cè)[7 - 9]。對(duì)于SPME取樣條件的研究,一般以所得色譜峰個(gè)數(shù)或色譜峰面積為指標(biāo)，即用提取量作為評(píng)估萃取效率的主要依據(jù)，但這樣不能表現(xiàn)該提取方法對(duì)不同化合物的選擇性[10]。僅以峰個(gè)數(shù)和峰面積表征整個(gè)色譜圖,無(wú)法得到完整信息,而且重疊峰、噪聲水平等因素也會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生較大影響。本實(shí)驗(yàn)以信息量[11]和重現(xiàn)性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)選擇適合煙用料液的提取方案，建立并優(yōu)化了煙用料液的SPME-GC指紋圖譜方法，結(jié)果證實(shí)其顯著優(yōu)于乙醚液-液萃取的GC-MS法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、裝置與材料

Aglient 7890N氣相色譜儀(美國(guó)，Aglient公司)，配Agilent 5975 型質(zhì)譜檢測(cè)器；Milli-Q型超純水裝置(美國(guó)，Millipore公司)；GERSTEL 三合一(固相微萃取、靜態(tài)頂空、溶液進(jìn)樣)自動(dòng)進(jìn)樣器(德國(guó)，GERSTEL公司)；100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)、85 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、50 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭(美國(guó)，Supelco公司)。

煙用料液A#(湖南中煙技術(shù)研發(fā)中心提供)；蒸餾水(自制)。

1.2 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，分流比10∶1；程序升溫：初始溫度為70 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫到250 ℃,再以10 ℃/min升至280 ℃。質(zhì)譜條件：電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描范圍35～450 amu。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1萃取頭的老化首先將不同極性的100 μm PDMS、65 μm DVB/PDMS 、85 μm CAR/PDMS，50 μm DVB/CAR/PDMS 四種固相萃取纖維頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化。老化溫度及時(shí)間如表1所示。

表1 各種萃取頭老化溫度及時(shí)間

1.3.2液-液萃取方式準(zhǔn)確移取15 mL料液于50 mL錐形瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醚、室溫下?lián)u床震蕩10 min，靜置15 min，待分層后取乙醚層。重復(fù)萃取3次，合并萃取液，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至約1 mL，加入無(wú)水Na2SO4，室溫下放置過(guò)夜。

1.3.3固相微萃取取0.5 g料液于20 mL的頂空瓶中，加入12 mL水，分別加入0、0.25、0.075、0.125 g的NaCl ，搖勻后放入三合一自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別用100 μm PDMS、85 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDM、50 μm DVB/CAR/PDM四種萃取纖維頭進(jìn)行固相微萃取。待萃取完成后，按1.2節(jié)進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)萃取纖維頭的類型[13]、萃取溫度[14,15]、萃取時(shí)間、脫附時(shí)間這四個(gè)因素影響被分析物從萃取頭轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管柱中是否完全，PDMS萃取纖維頭對(duì)極性物質(zhì)的萃取效率低于非極性物質(zhì)，NaCl的加入將有利于極性物質(zhì)的析出。因此,采用正交實(shí)驗(yàn)，選擇萃取纖維頭的類型、萃取溫度、萃取時(shí)間、脫附時(shí)間、加入NaCl的相對(duì)百分含量這五個(gè)因素，在四個(gè)不同的水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。制定的正交實(shí)驗(yàn)表見(jiàn)表2；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)以信息量和丙二酸二乙酯、胡椒醛、綠葉醇等幾個(gè)峰的面積總和為指標(biāo)確定較優(yōu)水平。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表(L54)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 信息量的計(jì)算

對(duì)于連續(xù)信號(hào),根據(jù)Shannon信息理論及不重疊的正態(tài)分布峰具有最大熵的理論基礎(chǔ),其信息量可由下式表達(dá)[16,17]:

(1)

其中,Px表示具有概率性質(zhì)(其積分等于1)的連續(xù)色譜信號(hào)。是化學(xué)組分在分布函數(shù)中的存在概率或濃度。對(duì)于一個(gè)色譜指紋圖譜,先將所得色譜進(jìn)行歸一化處理后,其信息量可用下式計(jì)算:

(2)

其中,Px為色譜指紋圖譜中的色譜響應(yīng)值,而sum(Px)表示色譜響應(yīng)值Px的總和。

式2所得∮值，即為色譜指紋圖譜中得到的信息量值。由此求得的色譜指紋圖譜的信息量既具有信息理論基礎(chǔ)且計(jì)算簡(jiǎn)單,無(wú)需計(jì)算各色譜峰面積,同時(shí)還考慮了色譜重疊峰的影響 。本文所有信息量的計(jì)算都是先將色譜歸一化處理后按式(2)計(jì)算所得。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表3中極差R可以看出，各因素的重要性順序?yàn)椋篈>D>E>C>B,即是萃取頭的影響最大，其次是脫附時(shí)間、NaCl的百分含量、萃取溫度、萃取時(shí)間。以信息量和丙二酸二乙酯、胡椒醛、綠葉醇峰面積最大為原則，確定最優(yōu)的固相微萃取條件為：85 μm CAR/PDMS萃取纖維頭、萃取溫度為60 ℃、萃取時(shí)間為50 min、脫附時(shí)間為10 min、NaCl的百分含量為0%(即不加入NaCl)。最優(yōu)水平為A3B1C3D4E1。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

2.3 樣品測(cè)試和提取方法穩(wěn)定性的考察

按照最佳取樣條件，即85 μm CAR/PDMS萃取纖維頭，萃取溫度為60 ℃、萃取時(shí)間為50 min、脫附時(shí)間為10 min、不加入NaCl，對(duì)料液A#用同一時(shí)間相同方法平行試驗(yàn)5次考察其重現(xiàn)性;在相同色譜條件下對(duì)提取的樣品進(jìn)行測(cè)定，將得到的色譜圖進(jìn)行保留時(shí)間漂移校正后，以5個(gè)譜圖的平均譜圖為標(biāo)準(zhǔn)譜圖模式，并計(jì)算各譜圖與平均譜圖的全譜相似度并計(jì)算其平均相關(guān)系數(shù)。按1.3.2中的方法對(duì)料液進(jìn)行乙醚液-液萃取，表4中列出了固相微萃取和乙醚液-液萃取兩種提取方法所得到的信息量平均相關(guān)系數(shù)及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 。從表4可以看出SPME前處理方法在連續(xù)進(jìn)樣時(shí)具有相對(duì)較好穩(wěn)定性。雖然萃取纖維頭在使用一段時(shí)間間隔內(nèi)會(huì)出現(xiàn)固定液的流失等造成吸附能力下降、最終造成穩(wěn)定性下降[10]。但是由于這個(gè)過(guò)程是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，因此對(duì)于在同一時(shí)間內(nèi)的連續(xù)進(jìn)樣具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性。乙醚液-液萃取過(guò)程中由于萃取溶劑乙醚易于揮發(fā)，并且濃縮等過(guò)程帶來(lái)部分物質(zhì)揮發(fā)性的流失，造成較大的實(shí)驗(yàn)偏差，影響此方法的穩(wěn)定性。固相微萃取的過(guò)程本身包含萃取富集過(guò)程，因此不需要重復(fù)的富集濃縮等操作。

表4 料液不同提取方法得到的信息量及穩(wěn)定性(n=5)

SPME相對(duì)乙醚液-液萃取可以得到較大的信息量，碳分子篩與聚二甲基硅氧烷復(fù)合的固相微萃取的萃取頭普遍適用與水中有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定，因此也適用于煙用料液揮發(fā)性的組分的提?。欢颐岩?液萃取過(guò)程會(huì)有較大的溶劑峰而影響信息量的計(jì)算，兩種萃取方法得到的總離子流圖見(jiàn)圖1。與NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)相對(duì)照，選取正、反向匹配對(duì)均大于80%的確定為已知物，對(duì)各組分進(jìn)行初步定性分析，SPME法共鑒定出34種物質(zhì)，定性分析結(jié)果見(jiàn)表5；乙醚液-液萃取僅鑒定出21種成分，分別是：乙酸、丙二醇，一縮丙二醇、戊醛丙二醇縮醛、丙二酸二乙酯、麥芽酚、甲基環(huán)戊基烯醇酮、香蘭素、吡喃酮、苯甲酸、5-羥甲基糠醛、胡椒醛、3-(2-羥苯基)丙酸甲酯、對(duì)羥基苯丙酸、對(duì)甲氧基苯乙酮、覆盆子酮、異香草醛、洋茉莉醛和丙二醇醛、十六烷酸、(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸、3,4-二甲氧基苯甲酸乙酯；SPME與用乙醚液-液萃取法相比多提取出的組分有茄酮、橙花叔醇、葉綠醇及一些醛酮及酯類化合物。這些的組分是反映煙用料液A#重要組分信息：如茄酮具有煙草本香，使煙氣豐滿又醇和細(xì)膩；葉綠醇在調(diào)制過(guò)程中可以轉(zhuǎn)化為具有清香氣息的新植二烯，其含量的高低不僅直接影響煙葉的吃味和香氣,而且還影響其他致香成分的形成。

圖1 乙醚液-液萃取(a)和固相微萃取(b)兩種方法提取料液A#的總離子流色譜圖

表5 料液A#固相微萃取GC-MS鑒定結(jié)果

(續(xù)表5)

3 結(jié)論

建立了在線固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析煙用料液的指紋譜圖的方法，得到的優(yōu)化條件為：萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間50 min、不加入NaCl、85 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取纖維頭。通過(guò)對(duì)在線固相微萃取與乙醚液-液萃取兩種提取方法比較，結(jié)果表明固相微萃取可以獲得相對(duì)較多的信息量和相對(duì)較好的穩(wěn)定性；固相微萃取在揮發(fā)性組分少含量低的煙用料液分析及其氣相色譜指紋圖譜的建立方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。該方法可以為煙用料液招標(biāo)工作及煙用料液質(zhì)量控制打下基礎(chǔ)。