陳國妮，孫飛龍，閆亞茹

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科一年生草本植物，含有豐富的營養(yǎng)成分，尤其是活性成分中的黃酮，具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化和抗癌等多種藥效功能（金蘭和陳宇杰，2010）。

目前，已見報(bào)道的提取馬齒莧黃酮的方法主要有溶劑提取、超聲波輔助提取和微波輔助提取等（吳現(xiàn)芳等；2013；吳昊等；2012；李杏元和陳國安；2012），但這些方法均存在提取效率不高、低耗能和對有效成分造成不良影響等不足。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析方法對微波輔助提取馬齒莧黃酮進(jìn)行研究，確定其最佳工藝，同時(shí)采用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化工藝研究，為其生物功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 馬齒莧：采自西安市市郊。無水乙醇、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純；大孔吸附樹脂AB-8、D101、D3520、HPD300、HPD600、聚酰胺，均為分析純。

立式電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGF-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）、電子天平 [AL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、紫外可見分光光度計(jì)（752N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（申科R-205型，上海申順生物科技有限公司）、微波爐（KD21C-C2型，順德市美的微波爐制造有限公司）、多功能粉碎機(jī)（XS-04型，上海兆申科技有限公司）、循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）型，鞏義市英峪予華儀器廠]。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 馬齒莧除去殘根雜質(zhì)，洗凈，自然陰干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用多功能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 馬齒莧黃酮的提取與測定

1.2.2.1 馬齒莧黃酮的提取 稱取馬齒莧干粉1.0 g放入250 mL錐形瓶中，加入30 mL 95%乙醇，在室溫下浸泡并搖勻，在50 W的微波爐中加熱10 min。用真空泵抽濾處理后的馬齒莧乙醇提取液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮（溫度70℃），獲得馬齒莧黃酮濃縮液，密封保存（翟碩莉，2012）。

1.2.2.2 黃酮定性檢測 將提取液點(diǎn)于濾紙片上，置于氨水瓶口，顯微黃色，移開濾紙片數(shù)分鐘后，微黃色又消褪，證明該提取物中含有黃酮存在（Chen 和 Yu，2002）。

1.2.2.3 馬齒莧總黃酮得率計(jì)算 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%乙醇定容于10.0 mL容量瓶，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)祁英等（2010）比色法測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在波長510 nm下測其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出總黃酮的濃度，按公式計(jì)算總黃酮提取率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁濃度C（g/L）與吸光度A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程如下：

式中：Y為總黃酮得率，mg/g；C為吸光度為A時(shí)由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品液的質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品液的體積，mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧中總黃酮的提取條件在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合Box-Behnken（Yamazaki等，1987）設(shè)計(jì)方案，采用響應(yīng)面法分析各因素對因變量總黃酮得率的影響，并優(yōu)化其提取條件。因素與水平見表1。

表1 中心組合Box-Behnken試驗(yàn)的因素與水平

1.2.4 大孔吸附樹脂分離純化馬齒莧總黃酮

1.2.4.1 樹脂預(yù)處理 首先用蒸餾水浸泡樹脂，放置24 h；然后瀝干蒸餾水，依次加入適量濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液浸泡；數(shù)小時(shí)后，再用蒸餾水對樹脂進(jìn)行反復(fù)沖洗，用pH試紙測其酸度，直到中性為止。洗滌完后，進(jìn)行動態(tài)洗脫，上柱加入一定量體積90%的乙醇溶液，乙醇洗脫完之后，加蒸餾水將殘留的乙醇洗脫干凈，若洗脫液不澄清，則繼續(xù)洗脫。

1.2.4.2 靜態(tài)飽和吸附解析試驗(yàn) 本試驗(yàn)選取了 AB-8、D101、D3520、HPD300、HPD600、 聚酰胺等幾種不同樹脂進(jìn)行上柱層析。先分別稱取2 g預(yù)處理的大孔吸附樹脂，置于100 mL的錐形瓶中，精確加入馬齒莧黃酮提取液，持續(xù)搖蕩24 h，過濾。將濾過的樹脂另置于100 mL的容量瓶，加入80%的乙醇10 mL，繼續(xù)搖蕩，過濾。按照1.2.2.3的方法測其吸光度，計(jì)算吸附率與解析率。

式中：A0為初始液吸光度值；A1為吸附液吸光度值；A2為洗脫液吸光度值。

1.2.4.3 馬齒莧提取物中總黃酮純度的測定 將純化前、后的馬齒莧黃酮提取物濃縮制成浸膏，再依次加入適量乙醇進(jìn)行溶解、稀釋，前后溶液稀釋倍數(shù)為10和50。然后用分光光度法平行測其吸光度3次，求平均值。提取物中的總黃酮純度計(jì)算公式為：

式中：C為馬齒莧總黃酮的純度，%；n為稀釋倍數(shù)；A為測得黃酮的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧中總黃酮的提取條件采用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。 以微波時(shí)間（Z1）、乙醇濃度（Z2）以及微波功率（Z3）為自變量，總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用desinger expert軟件對響應(yīng)面分析。響應(yīng)值（Y）與自變量 Z1、Z2、Z3擬合得到響應(yīng)面的二次方程為：

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 由表3可知，模型中一次項(xiàng)Z1、Z3為顯著，Z2為極顯著，二次項(xiàng)為顯著為極顯著；整體模型的顯著水平P＜0.01，表明該模型極顯著。Pred（R2）為 0.9561，而Adj（R2）是 0.8770，說明擬合的模型方程較好，該模型可以用來指導(dǎo)試驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析及結(jié)果

2.3 各因素相互作用對總黃酮得率的影響 微波時(shí)間（Z1）、乙醇濃度（Z2）、微波功率（Z3）三因素對提取率（Y）的響應(yīng)面圖見圖1。

從響應(yīng)面3D圖的最高點(diǎn)和等值線可以看出，有極值存在于所選范圍內(nèi)，是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)；從響應(yīng)面圖的陡勢可直觀看出，微波時(shí)間與功率相互作用的曲面變化顯著，即對總黃酮得率影響最大。

圖1 各因素對提取率影響的響應(yīng)面圖

2.4 最佳提取工藝確定 通過Design Expert軟件得到的最優(yōu)提取工藝條件為：微波時(shí)間9.15 min、乙醇濃度78.68%、微波功率391.52 W，理論得率為21.8129 mg/g。實(shí)際的最佳提取工藝條件為：微波時(shí)間10 min、乙醇濃度75%、微波功率400 W，實(shí)際所得結(jié)果為21.2592 mg/g。此結(jié)果與理論預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面法可用于優(yōu)化馬齒莧黃酮微波提取工藝，準(zhǔn)確可靠，實(shí)用性較高。

2.5 樹脂型號的選擇 由表4可以看出，不同型號的樹脂，在相同條件下其吸附與解析能力均有所區(qū)別。D101、HPD300、HPD600和聚酰胺的吸附率較高，均達(dá)到了70%以上，而 D3520、HPD300、HPD600的解析率較好，綜合分析各樹脂對黃酮的吸附與解析能力，HPD600樹脂吸附率達(dá)到了80.40%，解析率為81.70%，所以選取HPD600樹脂為最佳填料，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.6 動態(tài)試驗(yàn)結(jié)果 通過進(jìn)行大量的純化試驗(yàn)，確定HPD600樹脂的純化工藝，最終確定的最佳純化工藝條件：馬齒莧黃酮上樣濃度為15 mg/mL，上樣量為2 BV，洗脫劑濃度為80%乙醇，洗脫劑用量3 BV。在該條件下由1.2.4.3公式計(jì)算，得到純化后的黃酮純度為81.87%，約是純化前20.35%的近4倍左右。

表4 6種樹脂的靜態(tài)飽和吸附率及解析率試驗(yàn)測定

3 結(jié)論

3.1 在3個單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法得到馬齒莧總黃酮最優(yōu)提取工藝條件為：微波時(shí)間10 min，乙醇濃度75%，微波功率400 W。

3.2 對 AB-8、D101、D3520、HPD300、HPD600、聚酰胺6種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附效果進(jìn)行了對比分析，試驗(yàn)結(jié)果表明HPD600樹脂純化效果最佳，所以選取HPD600作為馬齒莧黃酮的純化樹脂。

3.3 最終確定HPD600樹脂的最佳純化工藝條件為：上樣濃度為15 mg/mL，上樣量為2 BV，洗脫劑濃度為80%乙醇，洗脫劑用量3 BV。在該條件下，純化后的黃酮純度為81.87%，約是純化前20.35%的近4倍左右。

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