馮云琪

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223001）

明膠和阿拉伯膠均為具有良好生物親和性的天然高分子材料，明膠是一種蛋白質(zhì)，阿拉伯膠是一種多聚糖，均可作為微膠囊制備的理想壁材。在pH=4左右，明膠帶正電荷較多，阿拉伯膠帶負(fù)電荷較多，可中和形成復(fù)合物，再加入固化劑，形成交聯(lián)狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成囊 （孫燕婷等，2013）。凹土是一種天然非金屬粘土礦物質(zhì)，具有特殊纖維晶體形態(tài)結(jié)構(gòu)，具有較好的生物親和性，其本身可作為益生菌載體，當(dāng)在微膠囊壁材中添加該物質(zhì)時(shí)，又可較好地提高微囊的機(jī)械強(qiáng)度和通透性（趙玉萍等，2013、2012）。本試驗(yàn)以載菌凹土為芯材，以明膠、阿拉伯膠復(fù)合凹土作為壁材制備微囊膠，研究該壁材對(duì)益生菌在胃腸環(huán)境中的保護(hù)作用，旨在為飼料用益生菌制劑的制備提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 乳酸桿菌由江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過(guò)程集成工程實(shí)驗(yàn)室篩選保藏；凹土由江蘇省凹土資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、胃蛋白酶、胰蛋白酶購(gòu)自日本Sigma公司；其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

722N型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；TGL-16G-A型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSD-YX3200型立式雙層智能精密搖床 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；90-3型恒溫雙向磁力攪拌器（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基及人工胃腸液的配制 乳酸桿菌的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨 2 g，乙酸鈉 2 g，葡萄糖 20 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，吐溫-801 mL，水 1000 mL，pH 6.2 ～6.4（趙玉萍和方芳，2013）。

人工胃液：胃蛋白酶10g，NaCl 2 g，加水定容至 1000 mL，pH 2.5（趙玉萍等，2013）。

人工腸液：胰蛋白酶 10 g，KH2PO46.8 g，加水定容至 1000 mL，pH 6.8（李寧，2007）。

人工胃腸液均用0.2 μm濾膜過(guò)濾備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凹土的純化 將未經(jīng)處理的凹土研磨，過(guò)200目篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24 h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復(fù)3次（趙玉萍等，2012）。

1.3.2 復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊

1.3.2.1 復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊方法 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中于37℃靜置培養(yǎng)，2000 r/mim離心 10 min，取沉淀備用（趙玉萍等，2013）。

載菌凹土的制備：適量菌懸液和凹土在pH 6.5，35℃吸附40 min，冷凍干燥備用（趙玉萍等，2015；Rong 等，2008）。

微囊的制備：將適量明膠、凹土、載菌凹土和Tween-80于40℃混合，攪拌均勻，恒溫加入阿拉伯膠溶液，繼續(xù)攪拌均勻，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.6～4.0。

微囊的固化：上述混合液自然冷卻至25℃左右，再以冰浴冷卻至10℃以下，加入一定量戊二醛固化劑，攪拌15 min后，用10%NaOH溶液調(diào)pH至8～9，繼續(xù)攪拌至膠囊析出（于樂(lè)軍，2009）。

微膠囊的收集：離心收集并洗滌固化后的微膠囊產(chǎn)品。

1.3.2.2 明膠-阿拉伯膠復(fù)合凹土微囊制備的適宜條件的確定 適宜菌膠比例的確定：明膠-阿拉伯膠膠體質(zhì)量總濃度為4%（質(zhì)量比為1∶1），凹土0.2%，pH 4.0，于25℃反應(yīng) 20 min，菌膠質(zhì)量比例分別為 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9（菌體的量為載菌凹土的質(zhì)量），考察其對(duì)乳酸菌微膠囊包埋率以及模擬胃腸環(huán)境的釋放率的影響。

在單因素試驗(yàn)中，明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量分別為2%、3%、4%、5%、6%，其質(zhì)量比分別為1.5∶1、1.2∶1、1∶1、1∶1.2、1∶1.5， 凹 土 用 量 分 別 為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%， 反應(yīng)溫度分別為15、20、25、30、35 ℃，凝聚 pH 分別為 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0，反應(yīng)時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min。

1.3.2.3 微膠囊質(zhì)量初步評(píng)價(jià) 包埋率按以下公式計(jì)算：

活菌數(shù)測(cè)定采用菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法。

包埋前活菌數(shù)計(jì)數(shù)：取包埋前的菌液，稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后取0.2 mL涂布，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)。

未包埋活菌數(shù)計(jì)數(shù)：取微膠囊離心上清液，用無(wú)菌水洗滌數(shù)次，收集上清和洗滌液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后取0.2 mL涂布，37℃培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)。

1.3.2.4 耐胃腸環(huán)境試驗(yàn) 將1 g微膠囊置于100mL人工胃液中，于37℃水浴恒溫振蕩150r/min，分別于0、l、2、3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，然后將微膠囊于2000 r/min離心10 min并經(jīng)生理鹽水洗滌后，轉(zhuǎn)至100 mL人工腸液中，于37℃水浴恒溫振蕩150 r/min， 分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)與未經(jīng)包埋的菌體與載菌凹土作對(duì)照（尹尉翰等，2011）。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌膠比的確定 菌膠比對(duì)微囊包埋率影響較大，若菌膠比過(guò)高，菌體過(guò)量，壁材不能將菌體完全包裹；若菌膠比例過(guò)低，壁材過(guò)量，雖然包埋率高，但因包埋過(guò)于致密不利于菌體釋放。菌膠比對(duì)乳酸菌微膠囊包埋率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌膠比對(duì)包埋率的影響

由圖1可以看出，隨著菌膠比的不斷減小，微膠囊的包埋率不斷增大。當(dāng)菌膠比為1∶5時(shí)包埋率最低，為70.1%；菌膠比為1∶9時(shí)包埋率最高，為79.5%。當(dāng)菌膠比從1∶5降低到1∶8時(shí)，微膠囊粒徑有所減小，包埋率明顯提高，達(dá)79.3%，但隨著菌膠比的降低，微膠囊包埋菌體量亦逐漸降低，綜合包埋率和包埋量?jī)蓚€(gè)因素，確定菌膠比為 1∶8。

2.2 明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量的確定 壁材濃度過(guò)低或過(guò)高均會(huì)影響微膠囊產(chǎn)品的外觀均勻度和圓整性。若明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量過(guò)少，形成的微膠囊量少，包埋率亦隨之下降，若用量過(guò)多，加入戊二醛后會(huì)形成凝膠狀而非微膠囊。復(fù)合膠體用量對(duì)包埋率影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 復(fù)合膠體用量對(duì)微膠囊包埋率的影響

由圖2可以看出，隨著復(fù)合膠體用量的不斷增大，微膠囊的包埋率先增大后減小，當(dāng)復(fù)合膠體用量為4%時(shí)，包埋率最大為79.9%?？赡苁钱?dāng)復(fù)合膠體濃度較低時(shí)，膠體電離電荷較少，能夠形成的微膠囊數(shù)量少，包埋率亦較低；隨著復(fù)合膠體濃度的增大，兩者電離電荷增加，因此能夠形成的膠囊數(shù)量增加，包埋率增大；當(dāng)明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體的濃度大于5%時(shí)，由于復(fù)合膠體濃度過(guò)高、黏度較大，形成的微膠囊相互粘連，導(dǎo)致包埋率也隨之下降。

2.3 適宜明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比的確定 由圖3可知，隨著明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比的增加，微膠囊的包埋率先增加后減小，當(dāng)明膠∶阿拉伯膠為1∶1時(shí)，包埋率最大為90.4%，可能是因?yàn)槊髂z所帶正電荷和阿拉伯膠所帶負(fù)電荷恰好完全中和。

圖3 明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比對(duì)微膠囊包埋率的影響

2.4 適宜凹土用量的確定 載菌凹土減少了復(fù)凝聚過(guò)程中菌體的損失，在壁材中添加凹土?xí)黾游⒛z囊的機(jī)械強(qiáng)度（趙玉萍等，2012）。凹土用量對(duì)包埋率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 凹土添加量對(duì)微膠囊包埋率的影響

由圖4可知，隨著凹土用量的不斷增加，微膠囊的包埋率先增大后減小。當(dāng)凹土用量為0.4%時(shí)，包埋率最高為91.1%，再增加凹土用量包埋率反而下降，原因可能是隨著凹土用量的增加，降低了成囊性。

2.5 適宜復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)間的確定 足夠的反應(yīng)時(shí)間會(huì)使明膠-阿拉伯膠凹土復(fù)合體系反應(yīng)充分，可將菌體盡可能地充分包埋，保證了形成的微膠囊數(shù)量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響

由圖5可以看出，隨著復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)間的增加，微膠囊包埋率逐漸增加后趨于穩(wěn)定，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，包埋率已達(dá)到92.4%。

2.6 適宜凝聚pH的確定 在不同的pH條件下，明膠和阿拉伯膠帶電性質(zhì)不同，交聯(lián)反應(yīng)程度不同，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 凝聚pH對(duì)微膠囊包埋率的影響

由圖6可以看出，當(dāng)pH在3.9時(shí)，微膠囊的包埋率最高，為93.6%?？赡苁且?yàn)閜H為3.9時(shí)，明膠所帶的正電荷最多，而阿拉伯膠此時(shí)帶負(fù)電荷，因此形成的微膠囊量也最多（于樂(lè)軍，2009）。

2.7 適宜反應(yīng)溫度的確定 低溫時(shí)復(fù)凝聚反應(yīng)不易發(fā)生，因?yàn)槊髂z溶液呈凍凝狀，阿拉伯膠溶液黏度較大；高溫時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)速率較快，且不易凝聚在載菌凹土周?chē)?，因此?huì)影響微膠囊的形成，所以適宜的反應(yīng)溫度會(huì)對(duì)微膠囊的包埋率產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)微膠囊包埋率的影響

由圖7可以看出，隨著溫度的升高，微膠囊的包埋率先升高后下降，溫度為25℃時(shí)，包埋率最高，為93.3%。

2.8 微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中的釋放率 按上述方法和步驟制得乳酸菌微膠囊，經(jīng)冷凍干燥后獲得活菌制劑。將未經(jīng)任何保護(hù)的乳酸桿菌、負(fù)載在凹土上的乳酸桿菌和微膠囊制劑在模擬人工胃腸環(huán)境下進(jìn)行試驗(yàn)，0～3 h為模擬胃環(huán)境，3～15 h為模擬腸環(huán)境。由圖8可知，在胃環(huán)境中載菌凹土和微膠囊釋放比率接近，但在腸環(huán)境中，微膠囊能較長(zhǎng)時(shí)間地保持活菌比率，證明明膠-阿拉伯膠-凹土復(fù)合壁材對(duì)于乳酸菌具有較好的保護(hù)作用。

圖8 人工腸胃環(huán)境下活菌釋放率與時(shí)間的關(guān)系

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以明膠、阿拉伯膠復(fù)合凹土作為壁材，以載菌凹土作為芯材，制備乳酸桿菌微膠囊制品，經(jīng)人工模擬胃腸環(huán)境作用發(fā)現(xiàn)，載菌凹土與微膠囊在胃環(huán)境中的乳酸桿菌的釋放率接近，但在腸環(huán)境中，微膠囊中的乳酸桿菌卻能在很長(zhǎng)時(shí)間保持活性，說(shuō)明本試驗(yàn)中所用的壁材對(duì)乳酸桿菌具有較好的保護(hù)作用。在微膠囊的制備過(guò)程中，與僅以明膠、阿拉伯膠作為壁材的微膠囊相比，本試驗(yàn)所用的膠體總量、交聯(lián)pH、固化時(shí)間和溫度等參數(shù)均發(fā)生了變化，尤其是膠體用量從15%降為4%，但仍可保持較高的包埋率，節(jié)約了成本?？赡苁且?yàn)榘纪恋奶砑?，其表面的電荷影響了明膠、阿拉伯膠的表面電荷，從而使固化條件均發(fā)生了變化，關(guān)于這方面的機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

[1]李寧.雙歧桿菌微膠囊制備工藝及功能特性的研究：[碩士學(xué)位論文][D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[2]孫燕婷，黃國(guó)清，肖軍霞，等.阿拉伯膠/殼聚糖復(fù)凝聚相的制備及表征[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（2）：43.

[3]尹尉翰，雷涵，徐宇虹.海藻酸鈣微囊對(duì)乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境中的保護(hù)作用[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（8）：1228 ～ 1234.

[4]于樂(lè)軍.明膠/阿拉伯膠復(fù)凝聚微膠囊技術(shù)用于乳酸菌保護(hù)的研究：[碩士學(xué)位論文][D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2009.

[5]趙玉萍，方芳.應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].南京：東南大學(xué)出版社，2013.11.

[6]趙玉萍，黃穎娟，吳潔，等.以凹土為載體的新型益生菌制劑的制備[J].食品工業(yè)科技，2013，34（19）：141 ～ 144.

[7]趙玉萍，唐梓鑫，楊莉，等.凹土對(duì)乳酸球菌的吸附條件優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2015，1：46 ～ 49.

[8]趙玉萍，徐巖，王棟.固定化耶氏酵母提高產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯能力[J].食品工業(yè)科技，2012，33（6）：230 ～ 233.

[9]Rong X M，Huang Q Y，He X M，et al.Interaction of pseudomonas putida with kaolinite and montmorillonite：a combination study by equilibrium adsorption，ITC，SEM and FTIR [J].Colloids and surfaces B：Biointerfaces，2008，64：49 ～ 55.■