柯善恢，伍時華，張　健*，趙東玲，黃翠姬

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

氮源對釀酒酵母GJ2008不同糖濃度甘蔗汁酒精分批發(fā)酵的影響

柯善恢，伍時華，張健*，趙東玲，黃翠姬

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

研究了不同糖濃度下氮源對釀酒酵母GJ2008甘蔗汁酒精發(fā)酵的影響，旨在為高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵提供研究基礎(chǔ)。將2 g/L尿素加入150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L和350 g/L總糖質(zhì)量濃度甘蔗汁培養(yǎng)基中，以對應(yīng)糖濃度未添加氮源組為對照組，通過分析細胞生長、糖代謝和乙醇生成來探究氮源如何影響甘蔗汁酒精發(fā)酵。結(jié)果表明：與未添加氮源相比，氮源加快了發(fā)酵速度，發(fā)酵周期最高縮短為18 h，糖消耗速率和乙醇生成速率最大分別提高了55%和96%；使酒精發(fā)酵更徹底，總糖含量最高減少了40.42 g/L；增加了目的產(chǎn)物，乙醇含量最高提升了28.4%。說明氮源有效地促進了甘蔗汁酒精發(fā)酵，加強了酵母的無氧呼吸途徑。

氮源；釀酒酵母GJ2008；甘蔗汁酒精發(fā)酵；無氧呼吸途徑

甘蔗富含蔗糖、葡萄糖和果糖，價格低廉，被認為是生產(chǎn)燃料乙醇最理想的糖質(zhì)原料。乙醇作為生物能源，是最清潔的石油替代能源之一［1-3］。甘蔗汁酒精發(fā)酵最終酒精度偏低，高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵的發(fā)酵效率也不高，氮源可以有效促進高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵，但氮源如何影響甘蔗汁酒精發(fā)酵尚不清楚。氮源是構(gòu)成菌體物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物必需的營養(yǎng)元素，缺氮會使酒精發(fā)酵遲緩變慢［4］，甚至導(dǎo)致酒精發(fā)酵途徑的不完整。添加氮源幾乎對發(fā)酵過程所有參數(shù)都會產(chǎn)生有利影響［5］。為了弄清氮源如何影響酒精發(fā)酵，國內(nèi)外做了很多研究尤其是氮源對酵母生長的影響［6］。GUTIéRREZ A等［7-8］發(fā)現(xiàn)在不同氮源下的酵母細胞生長（細胞數(shù)）與發(fā)酵活力并沒有嚴格的相關(guān)性，但氮源可以提高最終發(fā)酵酒精度。BLOMQVIST J等［9］發(fā)現(xiàn)兼性厭氧酵母布魯塞爾德克酵母（Dekkera bruxellensis）在厭氧條件下酒精發(fā)酵必須補充氮源。

本試驗研究氮源對不同糖濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵的影響，通過分析酵母細胞生長、糖代謝和乙醇生成，探討添加氮源和不添加氮源對不同糖濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵的影響，為高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵提高研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

酒精酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

一級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

二級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將白糖加入至甘蔗汁中調(diào)節(jié)初始總糖質(zhì)量濃度150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L，分為加氮源和不加氮源兩組，調(diào)節(jié)pH 4.5，裝液量為200 m L/500 m L錐形瓶中。

以上培養(yǎng)基均于115℃蒸汽滅菌20 m in。

1.1.3試劑

甘蔗汁：廣西露塘糖廠；乙醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；尿素（分析純）：廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司；精制白糖：南京甘汁園糖業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SGD-IV還原糖測定儀：山東省科學(xué)院生物研究所；GC7890Ⅱ氣相色譜儀（配置火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測器和T2100P色譜工作站）：上海天美科學(xué)儀器有限公司；UPHW優(yōu)普系列超純水機：上海優(yōu)普實業(yè)有限公司；HWY-2112全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；1110M IKRO22R臺式冷凍離心機：德國Hettich公司；DMB5Motic數(shù)碼顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；XB.K.25血球計數(shù)板：北京科達有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1發(fā)酵方法

將32℃活化培養(yǎng)1～2 d斜面種子轉(zhuǎn)接至一級種子培養(yǎng)基中，搖床120 r/min、32℃培養(yǎng)12 h后按10%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基中，牛皮紙透氣膜封口，搖床120 r/min，32℃培養(yǎng)12 h后離心（4 000 r/min，10 min）棄上清，用無菌水將酵母泥振蕩均勻制成10倍濃縮菌懸液，備用。以10%（V/V）接種量將二級種子分別接入200 g/L、250 g/L和300 g/L發(fā)酵培養(yǎng)基中，將過濾除菌的尿素以0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L量加入三種濃度培養(yǎng)基中，此為確定尿素添加量的預(yù)實驗。確定尿素添加量后，將過濾除菌的尿素溶液加入至150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L發(fā)酵培養(yǎng)基中，以10%（V/V）接種量將二級種子接入培養(yǎng)基和與上述質(zhì)量濃度相同未添加尿素的培養(yǎng)基中，未添加氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組，裝液量為200 m L/500 m L，發(fā)酵條件同上。每組2個平行，實驗數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.2分析方法

總糖的測定：使用還原糖測定儀測定。細胞數(shù)的出芽率的測定：采用血球板計數(shù)法。死亡存活率測定：美蘭法［10］。乙醇濃度測定：采用氣相色譜儀測定發(fā)酵過程中乙醇濃度，用面積外標法分析酒精濃度。氣相色譜條件：氮氣（N2）作為載氣，柱溫控制為80℃，氣化室溫度150℃，檢測器溫度150℃，總載氣流速為92 m L/min，分流比為45∶1；發(fā)酵最終乙醇濃度用蒸餾法測定。

1.3.3數(shù)據(jù)處理

運用Origin 9.0軟件對發(fā)酵數(shù)據(jù)處理并作圖，運用Graph Pad Prism 5繪制和計算曲線下面積，數(shù)據(jù)處理按蔣凱［14］所述方法。

2　結(jié)果與分析

2.1氮源添加量的確定

因有機氮源成分復(fù)雜所以選尿素作為無機氮源，不同尿素添加量甘蔗汁酒精發(fā)酵最終乙醇濃度見表1。由表1可知，不同總糖質(zhì)量濃度（200 g/L、250 g/L和300 g/L）甘蔗汁在不同尿素添加量條件下，酒精發(fā)酵最終乙醇含量不同，當(dāng)尿素質(zhì)量濃度為2 g/L時，最終乙醇含量最高，分別為88.2 g/L、116.8 g/L和137.3 g/L。因此，尿素添加量確定為2 g/L。

表1　氮源添加量與最終乙醇含量的關(guān)系Table 1 Relationship between n itrogen source addition and alcohol concentration g/L

2.2氮源對酵母菌細胞生長的影響

不同總糖質(zhì)量濃度的甘蔗汁酒精發(fā)酵過程中氮源對酵母細胞生長、出芽率和死亡率的影響，如圖1所示。由圖1可知，相同糖濃度的甘蔗汁酒精發(fā)酵添加氮源與不添加氮源組（對照組）細胞數(shù)之間差距不大，250 g/L、300 g/L和350 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組的細胞數(shù)在12 h后會略高于對照組，說明添加尿素在高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵時能一定程度增加細胞數(shù)。100 g/L和150 g/L總糖質(zhì)量濃度時氮源組出芽率都明顯高于其對照組，但隨著總糖質(zhì)量濃度的增高氮源組和對照組之間的出芽率趨于相同，說明添加尿素在低糖質(zhì)量濃度時能增加細胞增長速率，高糖質(zhì)量濃度時這種優(yōu)勢隨總糖質(zhì)量濃度增高而減弱。隨著總糖質(zhì)量濃度的升高，乙醇含量在增加（350 g/L總糖質(zhì)量濃度除外），氮源組和對照組死亡率也明顯在增加，由此推測酵母死亡率很可能與酒精生成即無氧呼吸途徑有關(guān)。而對比250 g/L氮源組和對照組可知，氮源組與對照組最終乙醇含量相似，都屬于較高乙醇含量，高乙醇含量也會影響酵母細胞生長，但氮源組的酵母細胞死亡率比對照組高出131.7%，而且氮源組與對照組最大的區(qū)別是氮源組的發(fā)酵速率比對照組快很多，乙醇產(chǎn)率高出58.0%，所以酒精發(fā)酵強度即無氧呼吸作用強度很可能也是造成酵母的死亡率增高的因素之一，即酵母的無氧呼吸作用越強酵母的死亡率就越高。同一總糖質(zhì)量濃度氮源組與對照組比，氮源組死亡率高于對照組，尤其發(fā)酵最徹底的300 g/L總糖質(zhì)量濃度，氮源組死亡率是對照組的3倍多。BELL S J等［11］指出氮源與酒精發(fā)酵即無氧呼吸途徑密切相關(guān)，釀酒酵母缺氮會降低發(fā)酵性能和導(dǎo)致不完整的酒精發(fā)酵。VARONGSIRI K等［5］發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母在缺氮情況下酒精發(fā)酵后期酵母能明顯生長且保持高存活率（對比釀酒酵母）。氮源組比對照組的無氧呼吸更劇烈（乙醇產(chǎn)率更高），更徹底（殘?zhí)琴|(zhì)量濃度更低），生成的乙醇更多（乙醇含量更高），可見氮源強化了酵母的無氧呼吸途徑，又因為死亡率與無氧呼吸強度有關(guān)，最終尿素的添加增加了死亡率。

圖1　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對酵母菌細胞生長的影響Fig.1 Effect of nitrogen source on yeasts cell growth in sugarcane juice alcoholic fermentation

2.3氮源對甘蔗汁酒精發(fā)酵糖代謝的影響

圖2　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對殘?zhí)呛康挠绊慒ig.2 Effect of nitrogen source on the residual sugar content in sugarcane juice alcoholic ferm entation

由圖2可知，150～350 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組都比對照組糖消耗快，其中150 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組在18 h即達到總糖最低值而對照組達到最小值時為24h，故發(fā)酵周期縮短了6 h；其他糖濃度的氮源組發(fā)酵周期也都縮短6 h以上，說明氮源能夠明顯縮短甘蔗汁酒精發(fā)酵周期?？倸?zhí)乔€下面積（area under curve，AUC）可以整體的評價糖消耗的快慢［12］，總殘?zhí)茿UC越小說明糖消耗越快加快發(fā)酵過程［13-14］，氮源組總殘?zhí)茿UC都比對照組快（見表2），說明氮源加速了總糖的消耗，這與PRETORIUS I S等［4］的研究結(jié)果相似；MESSIAS M J等［15］也指出總糖質(zhì)量濃度較高時，氮源的加入效果會更加明顯。150～250 g/L總糖質(zhì)量濃度的氮源組和對照組之間最終殘?zhí)腔鞠嗤?，?00 g/L和350 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組殘?zhí)欠謩e比對照組小40.42 g/L和35.82g/L，說明氮源在高總糖質(zhì)量濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵時能顯著提高糖的利用率。350 g/L超高糖質(zhì)量濃度時，氮源組和對照組殘總糖比300 g/L總糖質(zhì)量濃度的高，乙醇含量比300 g/L總糖質(zhì)量濃度的低，說明酵母發(fā)酵能力已受到高總糖質(zhì)量濃度強烈地抑制。

由圖3可知，無論總糖質(zhì)量濃度高低，氮源組總糖消耗速率都高于對照組。發(fā)酵0～3 h，總糖消耗速率氮源組都比對照組大，其中150 g/L、200 g/L、250 g/L總糖消耗速率明顯高于300 g/L和350 g/L，說明總糖質(zhì)量濃度對酵母發(fā)酵的抑制作用在300 g/L時已開始表現(xiàn)出來，但無論糖質(zhì)量濃度高低尿素的添加都促進了糖代謝。發(fā)酵3～6 h，總糖消耗速率都有所升高，氮源組仍高于對照組。前6 h氮源組雖高于對照組，但相差并不大，氮源組總糖消耗速率表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢是在6 h后，6～12 h氮源組比對照組分別高出36%、43%、55%、55%和14%，12～18 h時，氮源組基本都比對照組高出30%左右，其中150 g/L總糖質(zhì)量濃度的氮源組由于糖提前消耗完而低于對照組。發(fā)酵18 h后除了因糖消耗完發(fā)酵結(jié)束外，氮源組總糖消耗速率都高于對照組。說明氮源的加入使各發(fā)酵階段糖消耗速率加快，主要作用階段在6 h之后；GEMMA B等［16］指出加入氮源總會加快糖消耗速率，但對數(shù)期效果更為明顯。

圖3　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對總糖消耗速率的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on total sugar consum ption rate in sugarcane juice alcoholic fermentation

圖4　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對比總糖消耗速率的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on total sugar specific consum ption rates in sugarcane juice alcoholic ferm entation

比總糖消耗速率為總糖消耗速率與活細胞數(shù)之比，能夠準確地表示單位活細胞與糖消耗速率之間的關(guān)系［14］。由圖4可知，無論總糖質(zhì)量濃度高低氮源組比總糖消耗速率基本都高于對照組，發(fā)酵0～3 h和3～6 h氮源組比總糖消耗速率基本高于對照組但不明顯，與總糖消耗速率相似，說明0～6 h階段氮源對單位活細胞的糖代謝能力提升有限，這是因為發(fā)酵初始階段，發(fā)酵液溶氧充足使酵母細胞伴有有氧呼吸途徑，而且甘蔗汁本身含有一定量氮，所含氮源對無氧途徑的促進作用不明顯，氮源組與對照組的差異化不明顯。表現(xiàn)明顯差異的是在6 h后，氮源組的比總糖消耗速率明顯高于對照組，說明尿素的添加使單位活細胞的糖代謝能力提高，氮源組的總糖消耗速率總高于對照組本質(zhì)原因是氮源大大增強活細胞的酒精發(fā)酵即無氧呼吸途徑。

2.4氮源對甘蔗汁酒精發(fā)酵生成乙醇的影響

圖5　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對乙醇含量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on alcohol contents in sugarcane juice alcoholic fermentation

由圖5可知，150 g/L和200 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組和對照組最終乙醇含量一樣，但氮源組都比對照組提前到達最高乙醇含量，250～350 g/L總糖質(zhì)量濃度氮源組不僅比對照組提前達到最高乙醇含量而且最終乙醇含量分別比對照組提升了6.3 g/L、22.1 g/L和29.0 g/L（見表2）。說明氮源不僅加快了乙醇的生成而且還提高了乙醇的產(chǎn)量，在高糖質(zhì)量濃度表現(xiàn)得尤為明顯。

圖6　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對乙醇生成速率的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on alcohol producing rates in sugarcane juice alcoholic fermentation

由圖6所示，發(fā)酵0～6 h氮源組乙醇生成速率基本都比對照組高，發(fā)酵6～12 h氮源組乙醇生成速率遠大于對照組，分別高出對照組35%、47%、86%、94%和15%，這個時段也是各總糖質(zhì)量濃度乙醇生成速率最大的階段，發(fā)酵18 h后有些氮源組因發(fā)酵提前結(jié)束而使得乙醇生成速率低于對照組，其余氮源組都高于對照組，總體趨勢與總糖消耗速率基本一致。說明氮源提高了乙醇的生成速率，在6 h后表現(xiàn)得尤為明顯。

圖7　甘蔗汁酒精發(fā)酵中氮源對比乙醇生成速率的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on alcohol specific producing rates in sugarcane juice alcoholic ferm entation

比乙醇生成速率能夠準確地表示單位活細胞與乙醇生成之間的關(guān)系［14］。由圖7可知，發(fā)酵0～6 h氮源組稍高于對照組，由于這個階段無氧呼吸途徑并不劇烈，氮源對酵母活細胞酒精發(fā)酵促進作用有限。6～12 h氮源組遠高于對照組，其中250 g/L氮源組的比乙醇生成速率最大4.44×10-11g/h，比對照組高42.9%，對照組單位活細胞的產(chǎn)乙醇生成速率遠遠低于氮源組。說明氮源的加入使單位活細胞的乙醇生成能力增強。

2.5氮源對甘蔗汁酒精發(fā)酵主要發(fā)酵參數(shù)的影響

不同總糖質(zhì)量濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵主要參數(shù)見表2。由表2可知，添加氮源幾乎對發(fā)酵過程所有參數(shù)都產(chǎn)生了有利影響，這與VARONGSIRI K等［5］的研究結(jié)果一致。在總糖質(zhì)量濃度不高（150 g/L和200 g/L）時，氮源組比對照組的發(fā)酵周期縮短6 h，乙醇產(chǎn)率分別高32.9%和28.7%，氮源加快了酒精發(fā)酵即無氧呼吸途徑。250～350 g/L不僅縮短發(fā)酵周期和提高乙醇產(chǎn)率，還使乙醇含量分提高5.7%、19.5%和28.4%，總糖發(fā)酵效率分別提高了4.9%、14.4%和15.2%，也使殘總糖降低，提高了糖的利用率。

表2　不同糖濃度氮源組與對照組甘蔗汁酒精發(fā)酵主要參數(shù)Table 2 Major param eters of the n itrogen source groups and control group w ith different sugar concentration during thesugarcane juice alcoholic fermentation

3　結(jié)論

本實驗研究了氮源對酒精酵母GJ2008不同總糖質(zhì)量濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵的細胞生長、糖代謝和乙醇生成的影響。結(jié)果表明：氮源加速了酒精酵母GJ2008的酒精發(fā)酵即無氧呼吸途徑，糖消耗和乙醇生成都更快；氮源使酒精發(fā)酵更徹底，殘?zhí)歉?；氮源使酵母產(chǎn)生了更多的目的產(chǎn)物，乙醇含量更高。總之，氮源的添加有效地促進了酒精發(fā)酵，同時氮源的加入增強了酵母發(fā)酵能力也加速了酵母菌的死亡速率。氮源是構(gòu)成菌體的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成不可缺少的元素，氮源對酒精發(fā)酵的促進可能與丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶有關(guān)，也可能與糖酵解途徑一種或幾種酶有關(guān)，具體原因需要進一步研究。本研究探索氮源對甘蔗汁酒精發(fā)酵過程的影響，發(fā)現(xiàn)氮源對甘蔗汁酒精發(fā)酵有明顯促進作用，尤其在高總糖質(zhì)量濃度表現(xiàn)得更明顯，旨在為高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵和補料發(fā)酵提供研究基礎(chǔ)。

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Effect of nitrogen source on sugarcane juice batch alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae GJ2008 w ith different sugar concentrations

KE Shanhui，WU Shihua，ZHANG Jian*，ZHAO Dongling，HUANG Cuiji
（School of Biological and Chem ical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

In order to provide research basis for alcoholic fermentation of high sugarcane juice concentration，the effects of nitrogen on sugarcane juice alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae GJ2008 w ith different sugar concentrations were researched.2 g/L carbamide was added into the sugarcane juice mediums with sugar concentration of 150 g/L，200 g/L，250 g/L，300 g/L and 350 g/L.Using the corresponding sugar concentration groups without nitrogen source as control group，the effects of nitrogen source on sugarcane juice alcoholic fermentation were investigated by analyzina cell grow th，glycometabolism and the alcohol generation.The results showed that compared with control group w ithout nitrogen source，the nitrogen source could speed up the fermentation，and the fermentation period was shortened and the shortest period was 18 h.The sugar consumption rate and alcohol generation rate were increased by 55%and 96%，respectively，which made alcoholic fermentation more thoroughly，and the total sugar content was decreased by the highest for 40.42 g/L.The aimed products were increased，and the alcohol concentration increased by 28.4%.The study indicated that nitrogen source effectively promoted the sugarcane juice alcoholic fermentation and strengthened the anaerobic respiration of yeast.

nitrogen source；Saccharomyces cerevisiae GJ2008；sugarcane juice alcoholic fermentation；anaerobic respiration

Q815

0254-5071（2016）05-0031-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．007

2016-03-05

廣西科技攻關(guān)項目（桂科攻0782003-2）；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項目（YB2014202）

柯善恢（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物代謝控制發(fā)酵。

張?。?964-），男，講師，本科，研究方向為微生物發(fā)酵技術(shù)。