珠美海棠Mz₂NHX1基因的克隆和序列分析

張永利等

摘要：以珠美海棠幼苗根系的cDNA為模板，根據(jù)珠美海棠NHX1（GQ503257）的保守序列設計引物，通過 RT-PCR 擴增得到目的基因全長1 865 bp，包含1個1 635 bp的開放閱讀框，編碼544個氨基酸，其核苷酸序列與蘋果（GU338395）、玫瑰（KC188664）、楊樹（ACU01853）的核苷酸序列同源性分別是95%、93%、91%。其對應的氨基酸序列與擬南芥（AAF21755）、玫瑰（BAD93487.1）和大葉補血草（BAB11940）液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列的同源性分別是79%、87%、79%，說明該蛋白是一種定位于液泡膜的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，該基因?qū)儆谝号菽a+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因。它編碼的蛋白質(zhì)分子量為60.5 ku，理論等電點（pI）為8.85，二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和不規(guī)則卷曲構(gòu)成，其N-末端具有12個跨膜疏水片段，C-末端具有親水的長鏈尾巴，在跨膜片段內(nèi)含有氨基酸保守序列85-LFFIYLLPPI-94，是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑氨氯吡嗪咪的結(jié)合位點。

關鍵詞：珠美海棠；Mz2NHX1基因；克??；生物信息學；耐鹽機理

中圖分類號： Q785；S685.120.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0020-05

鹽害是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因子之一，它對植物的傷害表現(xiàn)為離子不平衡、水分虧缺和離子毒害[1]。土壤中過多的Na+導致植物細胞的膜功能失調(diào)、代謝活動衰減及其他次生影響，使植物生長受到抑制，直至細胞死亡[2-3]。為避免鹽的毒害作用，植物形成了特殊的耐鹽機制，即限制Na+吸收、增加Na+外排及Na+區(qū)隔化[4]。這3種途徑主要與細胞質(zhì)膜上和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白有關。編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因首先從酵母中克隆得到[5]，隨后從擬南芥中克隆到SOS1[6]，SOS1基因與真菌中編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因有很高的同源性，并且SOS1基因的突變體對鹽脅迫非常敏感，鹽脅迫可以增SOS1基因的表達，說明SOS1在擬南芥的耐鹽機制中起重要作用。由于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白可以將Na+外排或區(qū)隔化到液泡中，因此它們在維持細胞滲透平衡中具有重要作用[7]。在植物中，液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白（NHX1）的活性最初在甜菜堿儲藏組織的液泡形成體的小泡囊中觀察到，后來從擬南芥、水稻和冰葉日中花中分別克隆了液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因AtNHX1[8]、OsNHX1[9]和McNHX1[10]，并且發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可以增加它們的表達，說明NHX1基因在植物的耐鹽機制中起關鍵作用。因此通過研究Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的耐鹽機理，可以為培育優(yōu)良的耐鹽種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

珠美海棠為薔薇科（Rosacaeae）蘋果屬（Malus）多年生木本植物，有較高的應用價值。該樹種耐鹽堿、抗寒能力強，在鹽堿地較重的地區(qū)可作砧木嫁接蘋果，成活率較高。它在含鹽量0.6%、pH值9.2的土壤中也能正常生長[11]。推測這種高度的耐鹽能力與植物的耐鹽基因有關。

關于植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的研究已有很多報道，但是對珠美海棠的相關研究報道很少。筆者在前期研究（GQ503257）的基礎上，以珠美海棠組培生根苗為試材，克隆了珠美海棠NHX1的同源基因Mz2NHX1，并對Mz2NHX1基因進行了序列分析和生物信息學分析，旨在為研究該基因的功能、探討珠美海棠的耐鹽機制奠定基礎，同時也為耐鹽基因的利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

珠美海棠[Malus zumi （Matsum.） Reder]組培生根苗，由天津農(nóng)學院果樹學重點實驗室提供。Recombinant DNase Ⅰ（RNase-free）、Ribonuclease Inhibitor、Oligo d（T）18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0購自TaKaRa公司；RNase/DNase Free槍頭、RNase/DNase Free離心管、Ampicillin、X-gal、IPTG、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；克隆載體試劑盒 pEASY-T1 Cloning Kit 和大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA測序由華大基因有限公司完成。其他藥品均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1珠美海棠總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄取0.1 g珠美海棠幼苗根系，用改良的CTAB法提取RNA，并用DNaseⅠ處理去除DNA污染，電泳檢測其質(zhì)量；利用微量紫外分光光度計（NANODROP 2000）測定RNA濃度，根據(jù)寶生物反轉(zhuǎn)錄酶說明書取適量M-MLV酶和RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計與目的基因的擴增根據(jù)已克隆的珠美海棠NHX1基因的保守序列，設計1對特異引物P1：5′-AGGAGGCGGATACAATGGCT-3′和P2：5′-CAACCGATGTGCTTGGGAC-3′，利用RT-PCR反應擴增目的基因的全長序列。根據(jù)全長序列設計特異引物P3：5′-CGGGGTACCCCGATGGCTGTTCCACATTTG-3′和P4：5′-CCGGAATTCCGGTTGCCACTGAACGTTGTTG-3′，擴增目的基因的開放閱讀框序列。擴增體系（20 μL）：10×Ex PCR buffer 2.0 μL，dNTP Mix 1.6 μL，引物P1和引物P2各0.8 μL，cDNA模板1.5 μL，Ex Taq 0.1 μL，DEPC-d2H2O 13.2 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，后延伸10 min，30個循環(huán)，4 ℃短暫保存。endprint

1.2.3目的片段的檢測與鑒定使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段，將目的片段與pEASY-T1載體連接15 min，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，整個過程要輕柔。在不含Amp的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃條件下、200 r/min搖菌1 h，然后在含有IPTG和X-gal的 LB（+Amp） 固體培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落至LB（+Amp）液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min下?lián)u菌培養(yǎng)8 h，以菌液為模板做PCR，鑒定陽性重組子。提取質(zhì)粒，通過雙酶切法（EcoRⅠ，KpnⅠ）鑒定目的片段是否成功連入載體，用鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因公司測序。

1.2.4目的基因的生物信息學分析利用NCBI的BLASTn和BLASTp進行核苷酸及氨基酸序列相似性分析；采用DNAMAN軟件進行多序列比對，并預測蛋白質(zhì)的疏水性和親水性，采用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析；利用TMpred在線準確預測跨膜蛋白的跨膜片段，利用TMHMM在線對目的基因進行跨膜結(jié)構(gòu)域的預測；采用ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1珠美海棠Mz2NHX1基因的克隆和測序分析

用質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠檢測從珠美海棠中提取的RNA質(zhì)量，總RNA基本無降解，無蛋白質(zhì)污染，28 S、18 S和5 S條帶完整。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1條鏈后，以cDNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增得到1條1865 bp的目的條帶（圖1），與蘋果（GU338395）、玫瑰（KC188664）、楊樹（XM_002307158）的核苷酸序列的同源性分別為95%、93%、91%。通過NCBI的ORF Finder在線分析，預測開放閱讀框長1 635 bp。根據(jù)該核苷酸序列設計引物P3、P4，PCR擴增出其開放閱讀框序列（圖2），經(jīng)與pEASY-T1連接、轉(zhuǎn)化、藍白斑篩選，菌液PCR和酶切鑒定后測序，得到1 635 bp的核苷酸序列，測序結(jié)果與預測序列吻合，我們將該基因命名為Mz2NHX1。

2.2珠美海棠Mz2NHX1基因的生物信息學分析

2.2.1Mz2NHX1氨基酸序列分析經(jīng) NCBI 的 ORF Finder在線軟件分析，Mz2NHX1基因開放閱讀框長 1 635 bp，編碼1

個由 544 個氨基酸組成的蛋白 Mz2NHX1（圖3）。

通過Protparam在線分析可知，Mz2NHX1蛋白的分子質(zhì)量為60.5 ku，等電點（pI）為8.85，分子式為C2802H4377N699O749S20。用DNAman軟件分析發(fā)現(xiàn)，珠美海棠與擬南芥（AAF21755）、大葉補血草（BAB11940）和玫瑰（BAD93487.1）等液泡膜 Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列有較高的同源性，分別為79%、79%和87%，并且含有保守序列85-LFFIYLLPPI-94，是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑氨氯吡嗪咪的結(jié)合位點；以及鈣調(diào)素類蛋白（AtCaM15）的結(jié)合位點的氨基酸保守序列515-RKFDNAFMRPVFGGRG-536（圖4）。

用MEGA 5.0軟件對珠美海棠Mz2NHX1編碼的氨基酸與擬南芥、水稻及牽牛花、番杏、玫瑰、楊樹的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列進行了進化樹分析。結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，Mz2NHX1與蘋果（ADB92598）和玫瑰（BAD93487）的 Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列同源性達100%，而與牽牛花同源性達95%，與番杏和楊樹的同源性為 90%，與水稻的同源性為86%，親緣關系比較近。以上植物的NHX基因編碼蛋白均定位在液泡膜上，推測Mz2NHX1也是定位于液泡膜上。其主要功能是將過量的Na+區(qū)隔入液泡，避免Na+積累對細胞造成離子毒害，降低細胞滲透勢提高植物吸收水分的能力，抵御鹽脅迫對植物的滲透脅迫。

2.2.2Mz2NHX1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)對Mz2NHX1編碼的蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白編碼544個氨基酸，包含參與生物組成的所有氨基酸。用DNAman軟件分析，Mz2NHX1蛋白分子量為60.5 ku，等電點（PI）為8.85。由疏水性分析（圖6）可知，Mz2NHX1蛋白N-末端有12個跨膜疏水區(qū)域和1個較長的C-末端親水性尾巴。用TMHMM Server v.2.0在線軟件對其跨膜區(qū)域（圖7）進一步預測表明，Mz2NHX1的

N-端面向細胞質(zhì)，推測N-端的疏水區(qū)域可能含有與Na+結(jié)合的重要氨基酸殘基，并且可以形成跨膜螺旋，幾乎全部存在于液泡內(nèi)的C-端親水尾巴可能在對Na+和K+的選擇性吸收過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，將擬南芥AtNHX1的親水C-端去掉后，則可導致Na+/H+運輸?shù)南鄬Ρ嚷试鲩L[12]。因此，NHX1的跨膜結(jié)構(gòu)和親水尾巴可能在Na+的轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。

2.2.3Mz2NHX1蛋白結(jié)構(gòu)分析利用PORTER在線預測Mz2NHX1編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，Mz2NHX1蛋白由47.43%的α-螺旋、17.16%的β-折疊片、3.68%的β-轉(zhuǎn)角和31.80%的無規(guī)則卷曲組成（圖8）。

3討論與小結(jié)

植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是一種電中性轉(zhuǎn)運蛋白，不同植物中的該蛋白的N-末端具有高度同源性，該端是負責Na+轉(zhuǎn)運的區(qū)域，對Na+的競爭性抑制劑氨氯吡嗪脒及其衍生物敏感，C-末端是親水性長鏈尾巴，位于細胞質(zhì)或液泡囊腔內(nèi)，此結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有多個蛋白激酶作用位點，能與鈣調(diào)素結(jié)合，參與啟動多種信號的反應，是調(diào)節(jié)活性的區(qū)域 [13]。

有研究將AtNHX1基因在擬南芥上進行過量表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)擬南芥植株在200 mmol/L NaCl溶液澆灌下能正常生長發(fā)育[8]。將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入番茄中，過量表達AtNHX1基因的轉(zhuǎn)基因番茄在200 mmol/L NaCl濃度中能夠正常開花和結(jié)實，但是葉片中Na+濃度高于果實中Na+濃度 [14]。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)單一的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因能夠明顯提高植物耐鹽性，其原因可能是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)胫参锛毎?，激活了一系列與耐鹽相關的基因，從而明顯提高植物的耐鹽性，說明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)儆谀望}關鍵基因。因此，在利用轉(zhuǎn)基因技術培育耐鹽品種中有很高的應用價值。endprint

本研究通過將Mz2NHX1編碼的Mz2NHX1與已知Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列的同源性對比及系統(tǒng)發(fā)育分析，認為Mz2NHX1是一種定位于液泡膜的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，與擬南芥（AAF21755）、大葉補血草（BAB11940）和玫瑰（BAD93487.1）等液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列有較高的同源性，分別為79%、79%和87%，因此，

Mz2NHX1基因?qū)儆谝号菽a+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因。對Mz2NHX1核酸序列所翻譯的蛋白序列預測發(fā)現(xiàn)N-末端含有12個跨膜疏水區(qū)域和1個較長的C-末端親水性尾巴。對該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測分析可知，Mz2NHX1由47.43%的α-螺旋、17.16%的β-折疊片、3.68%的β-轉(zhuǎn)角和3180%的無規(guī)則卷曲組成。

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