龔秋菊

摘 要：植物細胞質雄性不育是廣泛存在于高等植物中的一種生物現象，利用CMS系及其恢復系，在育種上存在巨大的應用價值。不同的分子標記技術已被廣泛應用到植物的CMS研究中，從而發(fā)掘與CMS密切相關的細胞質基因。同時，利用分子標記輔助育種開發(fā)與恢復基因連鎖的分子標記，對提高育種效率有重要意義。本文就分子標記技術在植物的CMS研究進展進行概括論述。

關鍵詞：CMS；分子標記；線粒體；恢復基因

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.003

Abstract： Cytoplasmic male sterility is one of the biological phenomenon widespread in higher plants. Using CMS lines and its restorer lines has a huge application value in breeding. In order to excavate the cytoplasm genes that closely associated with CMS， different molecular marker technology has been widely applied to CMS studies. At the same time， using molecular-marker assisted selecting technology to exploit the molecular markers which interlock with the restoring genes， has an important significance to improve the efficiency of breeding. This paper summarized a review focusing on the progress on molecular marker technology in plant CMS.

Key words：CMS； molecular markers； mitochondrion； restorer gene

植物細胞質雄性不育系（cytoplasmic male sterility，CMS）最早是由Jones等于1936年首次在洋蔥中發(fā)現的一種生物現象，廣泛存在于高等植物中，其遺傳方式屬于母系遺傳[1]。植物CMS是指雌蕊發(fā)育正常、雄蕊發(fā)育不正常且不能產生正常功能花粉的現象。已有的研究結果主要集中在兩個方面：一是細胞質線粒體和葉綠體基因組結構、轉錄、翻譯方面的差異與CMS的關系；二是恢復基因的調控。隨著生物技術的發(fā)展，分子標記技術已被廣泛應用于植物CMS的研究，并發(fā)掘出與CMS密切相關的細胞質基因片段[2-5]。

1 線粒體與CMS的關系

根據前人的研究結果來看，研究者普遍認為導致植物CMS的主要因素與細胞質遺傳物質，尤其是線粒體基因組有關。目前對細胞質不育形成機理公認的觀點主要有兩種：一種是細胞質中線粒體與葉綠體基因組發(fā)生基因突變、重排，導致基因編碼的蛋白質喪失功能從而引起不育；另一種是線粒體基因重排的產物會阻礙花粉的正常發(fā)育，最終導致CMS。目前對線粒體基因與植物CMS關系的研究主要集中在以下幾個方面：（1）線粒體基因發(fā)生插入、缺失等基因突變；（2）線粒體基因組發(fā)生重排產生新的開放閱讀框；（3）線粒體RNA編輯異常；（4）線粒體能量代謝相關基因異常。

高等植物線粒體基因組不僅數量大（200～2 500 kb之間），而且結構復雜，主要以線型、開環(huán)、閉環(huán)、超螺旋等形式存在。并且線粒體基因組含有大量的正向重復序列、反向重復序列、非編碼序列和一部分未知來源的序列。線粒體基因組結構的復雜多樣性導致線粒體基因組極易發(fā)生重排、插入、缺失等突變。由于線粒體是細胞供能的主要場所，并且參與細胞分化、細胞凋亡、細胞信息傳遞等過程，這些過程任何一步發(fā)生異常都會導致線粒體功能異常，從而導致CMS的發(fā)生。目前，在水稻[6]、玉米[7-8]、棉花[9]、矮牽牛[10]、小麥[11]等多種植物的CMS研究中，已確定多個與CMS密切相關的胞質基因。

2 常用的分子標記技術

2.1 分子標記技術簡介

分子標記（molecular marker）技術是指能夠直接反映生物個體或種群間遺傳物質差異性的特異DNA片段，是直接以核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記。隨著分子生物技術的發(fā)展，已有十余種分子標記技術被用于基因克隆與定位、基因庫構建、物種親緣關系鑒定、分子標記輔助育種及遺傳多態(tài)性分析等方面的研究。

分子標記具有很多特點，如：（1）遺傳多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性強；（2）可以在不破壞遺傳物質結構，不影響基因表達的情況下揭示DNA的變異；（3）操作簡便快捷；（4）便于隱性性狀的選擇；（5）可檢測生長發(fā)育的不同階段及不同組織，分布均勻。根據分子標記的特點，通常將其分為以下幾類：（1）以分子雜交為基礎的分子標記，主要有RFLP；（2）以PCR為基礎的分子標記，其中以隨機引物PCR為基礎的分子標記技術有RAPD標記，以特異引物PCR為基礎的分子標記技術有SSR、ISSR、SRAP、SCAR等標記；（3）基于PCR與限制性酶切相結合的分子標記，其中通過對限制性酶切片段的選擇性擴增來表現多態(tài)性的分子標記，代表有AFLP標記。通過對PCR擴增片段的限制性酶切來表現多態(tài)性的分子標記，代表有CAPS標記[12]。

2.2 常用的分子標記技術種類

2.2.1 限制性片斷長度多態(tài)性（RFLP） 限制性片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）最早是由Grodzicker于1974年提出的，此技術是以DNA-DNA雜交為基礎的遺傳標記。其基本原理是：用特定的限制性內切酶對生物基因組DNA進行酶切，獲得大小不同的酶切片段，通過凝膠電泳分離后進行轉膜，用目的基因探針與酶切片段進行Southern雜交，通過顯影技術得到特異片段的RFLP圖譜。由于基因突變、重組等導致酶切位點的改變或酶切片段大小的改變均能形成RFLP多態(tài)性圖譜[13-14]。其優(yōu)缺點如下。RFLP標記技術作為一種常用的分子標記方法，具有很多優(yōu)點，如：（1）不受環(huán)境條件、組織特異性及顯隱性因素的影響；（2）標記位點在數量上沒有限制；（3）結果豐度高，穩(wěn)定性好，結果可靠。缺點：（1）所需要的DNA含量較多純度較高；（2）操作繁瑣，周期長，成本較高；（3）同位素探針也可能對人和環(huán)境造成損傷等[15]。

2.2.2 隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD） 隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphisms DNA，RAPD）是由Wiliam和Welsh等人于1990年在PCR技術基礎上發(fā)展而來的一項新的分子標記技術。其基本原理是：利用長為8～10 bp的隨機引物對基因組DNA進行PCR擴增，針對特定的基因型，由于每個引物都有與其特異結合的DNA位點，如果發(fā)生堿基插入、缺失、替換等突變，會導致特異結合位點的改變，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產物，就會得到DNA片段長度或數量的改變，從而檢測DNA片段的多態(tài)性[16-18]。RAPD標記技術與RFLP相比有以下優(yōu)點：（1）對DNA含量要求不高；（2）操作簡便、快捷，成本低；（3）能反映出整個基因組的多態(tài)性，具有較高的豐度；（4）引物可以適用于不同生物個體不同基因組結構的檢測。缺點：（1）穩(wěn)定性不高，重復性較差；（2）不能鑒別純合與雜合基因；（3）有很大的變異性，近親關系的物種間也可能產生極大差異[19-20]。

2.2.3 特征序列擴增區(qū)域（SCAR） 序列特征性擴增區(qū)域（sequence-characterized amplified region，SCAR）是首先由Parar和Michlmore提出的一種分子標記技術，它是在RAPD技術的基礎上發(fā)展起來的。其基本原理是：先對基因進行RAPD分析，將目標RAPD片段進行克隆和測序，根據原RAPD片段兩端序列設計特異引物并進行PCR擴增，其中引物通常是在RAPD引物的5端與3端延長14個堿基，長度為24 bp。目的是為了鑒別與原RAPD片段相對應的單一位點[21]。該技術與RAPD技術相比具有以下優(yōu)點：（1）檢測結果穩(wěn)定性好，重復性強；（2）顯性遺傳，直接根據有無擴增產物檢測；（3）操作簡便快捷[22]。

2.2.4 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP） 擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是由荷蘭科學家Vos等[23]創(chuàng)建的一種新型的分子標記，它同時結合了RFLP與RAPD技術的特點。其基本原理是：用兩種限制性內切酶對基因組DNA進行充分酶切，產生大小不同的DNA限制性片段，將雙鏈人工接頭與酶切片段進行連接，作為PCR擴增模板。用含有人工接頭互補序列、限制性內切酶識別序列、3端選擇性堿基的引物對模板進行預擴增與選擇性擴增，只有引物的選擇性堿基與限制性酶切位點側翼的3個核苷酸配對，才能擴增出產物，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據有無DNA指紋檢測多態(tài)性。其優(yōu)缺點：AFLP結合了RFLP和RAPD兩種分子標記技術的特點，具有多態(tài)性強、分辨率高，效率高、穩(wěn)定性強的優(yōu)點。但是該技術對DNA的純度與含量要求很高，不同材料需要不斷摸索最適的操作條件，并且酶的費用較昂貴。盡管AFLP標記技術產生比較晚，但被普遍認為是一種理想有效的分子標記技術。已被廣泛應用于水稻[24]、茶樹[25]、小麥[26]、辣椒[27]等多種作物的研究應用上。

2.2.5 SSR分子標記 簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR） 標記技術最早是在1989年由Litt等[28]建立的。SSR又稱微衛(wèi)星DNA，它是由1～6 bp的核苷酸為單位串聯重復組成的一段核苷酸序列，一般常見（CA）n和（TG）n串聯的雙核苷酸重復序列。SSR廣泛存在于基因組的各個座位上，其兩端的側翼序列多是保守的單拷貝序列，由于重復單位數量的不同會造成多態(tài)性發(fā)生。其基本原理是：根據SSR兩端保守序列設計特異引物，PCR擴增微衛(wèi)星DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出串聯重復數不同導致的PCR產物大小不同的多態(tài)性片段。其優(yōu)點有：（1）所需DNA量少；（2）呈共顯性遺傳，可鑒別純合基因和雜合基因；（3）可檢測到單一的多等位基因位點，穩(wěn)定性強。缺點：（1）SSR標記數量有限，開發(fā)引物難度大；（2）建立和篩選基因組文庫較費時。

3 分子標記技術在CMS中的應用

雜種優(yōu)勢（heterosis）是生物界中普遍存在的一種現象，它是指兩個遺傳性狀不同的親本雜交，產生的雜種一代繼承了其父母本的不同優(yōu)勢，在生活力、繁殖力、抗逆性、質量和產量等方面超過其雙親的現象[29]。利用CMS系及其恢復系，不僅可以省去人工去雄的繁瑣工作，而且為研究核質遺傳互作交流提供有價值的研究模型。因此CMS是雜種優(yōu)勢利用的基礎，國內外研究者廣泛將分子標記技術應用于多種作物的CMS研究，從遺傳學、生理生化等方面深入到分子水平。早在1976年，Levings等[30]率先將RFLP標記技術應用于玉米的CMS研究中，并篩選得到與玉米CMS相關基因。隨后，在水稻研究中，1994年，許仁林等[31]利用AP-PCR方法對6個水稻品種線粒體進行擴增，發(fā)現在不育系及F1代中與不育相關的特異片段。凌古元等[32]運用AFLP技術對野敗型水稻不育系、保持系及雜種F1代線粒體DNA進行比較分析，找出與不育相關的三條差異條帶，分別是ZA1、ZA2、ZA3。2002年，利用RAPD技術篩選出與水稻CMS相關的長為1 600 bp的特異片段[33]。在小麥中也均發(fā)現不育系與保持系mtDNA之間的差異，運用RFLP技術對3種小麥不育系（T、K、V型）的mtDNA進行對比，結果三者的mtDNA在結構上存在顯著差異，并且與其共同的保持系相比也有顯著不同[34]。黃占景等[35]利用RAPD技術，發(fā)現T型小麥不育系與保持系之間表現出多態(tài)性，其中有10個單引物和一組雙引物。隨后利用RAPD技術對小麥不育系89AR、保持系原冬3號及保持系的mtDNA進行比較研究，結果不育系與保持系間差異顯著，并推測這些差異與不育相關[36]。在棉花中，王學德[37]以哈克尼西棉CMS系及其保持系為材料，對其mtDNA和蛋白質進行SDS-PAGE、RFLP、RAPD分析，結果RAPD分析發(fā)現不育系和保持系線粒體基因組間存在明顯差異，以4個mtDNA探針進行RFLP分析，不育系mtDNA缺失一段1.9 kb的coxⅡ同源序列。蛋白質比較發(fā)現不育系中缺失一條分子量為31 kD的多肽，結果將這種coxⅡ基因的突變與蛋白質的缺失聯系在了一起。

4 分子標記在不育恢復基因方面的應用

傳統(tǒng)的育種方法在選育恢復系材料時，主要依賴于植物的表型進行選擇，需要通過連續(xù)多代回交并在開花期才能鑒別植株育性，這樣不僅費時費力，而且會受到環(huán)境條件影響。在長期的育種實踐和分子生物學發(fā)展的基礎上，分子標記輔助育種選擇技術（molecular-marker assisted selecting，MAS）已不斷運用到鑒別不育恢復系材料中，其基本原理是借助與目的基因緊密連鎖的DNA標記，達到選擇目標性狀的目的，能快速準確地對材料進行選育，極大地縮短了育種周期，提高了育種效率。應用于分子標記輔助育種的標記方法主要有RAPD、RFLP、SSR、AFLP等。

高等植物CMS的產生是受到細胞核與細胞質遺傳物質的共同作用結果，因此標記CMS恢復系的核恢復基因（Rfs）在育種過程中也至關重要。在棉花中，Lan等[38]發(fā)現一個與育性恢復基因Rf1有連鎖關系的RAPD標記UBC6592；Zhang等[39]利用AFLP標記技術篩選得到兩個與Rf3緊密連鎖的標記，CAPSE3P1和SCARE12M7。在油菜中，劉平武等[40]從可育池與不育池中利用RAPD、SSR、AFLP等標記技術進行篩選，獲得與Rfp基因緊密連鎖的2個分子標記。在水稻中，Tan等[41]篩選出2個與育性恢復基因緊密連鎖的RFLP標記；景潤春等[42]篩選出水稻野敗型細胞質雄性不育恢復基因緊密連鎖的ISSR標記UBC-835。在大豆中，王青山等[43]利用AFLP標記技術從恢復系中得到一段長310 bp的特異片段，并將其轉化為SCAR標記。

5 展 望

綜上所述，分子標記技術被廣泛用于植物CMS的研究中，并發(fā)揮重要作用。通過從分子水平對不育相關基因進行探索，以及對恢復基因定位等方面研究均取得了很大進展。但是這些研究遠不能滿足現代育種的需求，由于植物CMS及其育性恢復現象形成過程具有復雜多樣性，以及環(huán)境因素對其形成有很大影響，因此，植物CMS不育相關基因的機理還有待于進一步探索。隨著現代分子生物學技術的發(fā)展，各種新技術也不斷被開拓創(chuàng)新，分子標記技術也日臻完善。從與CMS相關基因的分子標記與定位等分子水平研究植物CMS分子機理，也會更準確、有效地用于CMS相關基因的定向育種，從而加快育種的進程。

參考文獻：

[1] WISE R P，PRING D R. Nuclear mediated mitochondrial gene regulation and male fertility in higher plants：Light at the end of the tunnel[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（16）：10240-10242.

[2] CUI X Q，WISE R P，SCHNABLE P S. The Rf2 nuclear restorer gene of male-sterile T-cytoplasm maize[J]. Science，1996，272（5 266）：1334-1336.

[3] BENTOLILA S，ALFONAO A A，HANSON M R. A pentatricopeptide repeat containing gene restores fertility to cytoplasmic male sterile plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（16）：10887-10892.

[4] KOIZUKA N，IMAI R，FUJIMOTO H，et al. Genetic characterization of a pentatricopeptide repeat protein gene，orf687，that restores fertility in the cytoplasmic male-sterile Kosena radish[J]. Plant J，2003，34（4）：407-415.

[5] ZHANG M F，CHEN L P，WANG B L，et al. Characterization of atpA and orf220 genes distinctively present in a cytoplasmic male-sterile line of tuber mustard[J]. Journal of Horticultural Science&Biotechnology，2003，78（6）：837-841.

[6] KADOWAKI K，SUZUKI T，KAZAMA S. A chimeric gene containing the 5'protion of atp6 is associated with cytoplasmic male-sterility of rice[J]. Mol Gen Genet，1990，224（1）：10-16.

[7] PRIOLI L M，HUANG J，LEVINGS C S. The plant mitochondrial open reading frame orf221 encodes a membrane-bound protein[J]. Plant Mol Biol，1993，23（2）：287-295.

[8] HEAZLEWOOD J L，WHELAN J，MILLAR A H. The products of the mitochondrial orf25 and orfB genes are F0 compone nts in the plant F1F0 ATP synthase[J]. FEBS Lett，2003，540（1-3）：201-205.

[9] WU J Y，GONG Y C，CUI M H，et al. Molecular characterization of cytoplasmic male sterility conditioned by Gossypium harknessii cytoplasm（CMS-D2） in upland cotton[J]. Euphytica， 2011（181）：17-29.

[10] HANSON M R，BENTOLILA S. Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development[J]. The Plant Cell，2004，16：154-169.

[11] HEDGCOTH C，el-SHEHAWI A M，WEI P， et al. A chimeric open reading frame associated with cytoplasmic male sterility in alloplasmic wheat with Triticum timopheevi mitochondria is present in several Triticum and Aegilops species， barley，and rye[J]. Curr Genet，2002，41（5）：357-365.

[12] 周宇爝.分子標記發(fā)展簡史[J].現代農業(yè)科技，2009（11）：264-270.

[13] TANKSLEY S D，YOUNG N D， PATERSON A H. RFLP mapping in plant breeding：New tools for an old science[J]. Biotechnology，1989（7）：257-264.

[14] HUANG N. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice：Maker-aid selection using RFLP and PCR[J]. Theor Appl Genet，1997（95）：313-320.

[15] 張漢堯.RFLP在植物遺傳育種研究中的應用[J].西南林學院學報，2006，26（l）：75-80.

[16] 劉春林，官春云，李木旬.植物RAPD標記的可靠性研究[J].生物技術通報，1999，15（2）：31-34.

[17] 錢惠榮，鄭康樂.DNA標記和分子育種[J].生物工程進展，1998，18（3）：12-18.

[18] WILLIAMS J K G， HANAFEY M K， RAFALSKI J A，et al. Genetic analysis using random amplified polymorphisms DNA markers[J]. Methods in Enzymology，1993（218）：704-740.

[19] 方宣鈞，劉思衡，江樹業(yè).品種純度和真?zhèn)蔚姆肿訕擞涜b定及其應用[J].農業(yè)生物技術學報，2000，8（2）：106-110.

[20] 倪新強，王忠華，夏英武.分子標記輔助選擇及其在水稻育種中的應用[J].中國農學通報，2001，17（3）：58-61.

[21] 田義軻，王彩虹，戴洪義，等.與蘋果Co基因緊密連鎖的RAPD標記的篩選及其SCAR標記轉換[J].遺傳學報，2004，31（9）：919-925.

[22] 劉俊峰，張國珍，馬秋娟，等.一個與稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik連鎖的SCAR標記的分離[J].植物病理學報，2003，33（2）：151-155.

[23] ZABEAN M，VOS P. Selective reseriction fragment ampli-fication：A general method for DNA fingerping[J]. European patent Application，1993： 92402629.

[24] MAEKILL D J，ZHANG Z，REDONA E D，et al. Level of polymorphism and genetie mapping of AFLP makers in rice[J]. Genome，1996（39）：969-977.

[25] PANL S，WACHIRA F N，POWELL W，et al. Diversity and genetic differentiation among populations of Indian and Kenyan tea revealed by AFLP markers[J]. Theor Appl Genet，1997（94）：255-263.

[26] BARRENT B A，KIDWELL K K. AFLP-based genetic diversity assessment among wheat cultivas from the Pacific Northwest[J]. Crop Sei，1998（38）：1261-1271.

[27] LANTER I S，Acquadro A，Quagl IOttil， et al. RAPD and AFLP assessment of genetic variation in a landrace of pepper（Capsicum annuum L）， grown in North-West Italy[J]. Genetic Rosources and Crop Evolution，2003（50）：723-735.

[28] LITT M， LUTYJ A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of dinucleotide repeats within the cardiac musele actin gene[J]. Am J Hum Genet，1989（44）：397-401.

[29] 王學德.雞腳葉標記的三系雜交棉雜種優(yōu)勢機理的研究[D].杭州：浙江大學，2006.

[30] LEVINGS C S， PRING D R. Restriction endonuclease analysis of DNA from normal and Texas cytoplasmic male sterile maize[J]. Science，1976（193）：158-160.

[31] 許仁林，國偉，汪訓明，等.雜交水稻及其“三系”線粒體DNA的AP-PCR指紋圖譜[J].遺傳學報，1994，36（1）：1-6.

[32] 凌古元，周培疆，關和新，等.運用AFLP技術篩選分離野敗型水稻mtDNA中與雄性不育性狀相關的片段[J].遺傳，1999，21（2）：33-36.

[33] HONG D L，ICHII M. RAPD markers frommitochonrial DNA can distinguishmale sterile and fertile cytoplasms in rice （Oryza sativa L.）[J]. Acta Agron Sin，2002，28（3）：315-320.

[34] 姚方印，孫蘭珍，李傳友，等.3種小麥細胞質雄性不育系及其雜種線粒體DNA的RFLP分析[J].西北植物學報，2000，20（5）：704-714.

[35] 黃占景，沈銀柱，劉植義，等.小麥T型細胞質雄性不育系與相應保持系線粒體DNA的RAPD分析[J].遺傳，1997，19（4）：8-11.

[36] 王岳光，楊典洱，王淋清，等.小麥輻射雄性不育系89AR及其保持系和恢復系線粒體DNA的RAPD分析[J].麥類作物學報，2002，22（2）：1-4.

[37] 王學德.細胞質雄性不育棉花線粒體蛋白質和DNA的分析[J].作物學報，2000，26（1）：35-39.

[38] LAN T，COOK C G， PATERSON A H. Identification of a RAPD marker linked to a male fertility restoration gene in cotton （Gossypim hirsutum L.）[J]. J Agric Genomic，1999（4）：299.

[39] ZHANG Z F，WANG Y，ZHENG Y L. AFLP and PCR-based markers linked to Rf3，a fertility restorer gene for S cytoplasmic male sterility in maize[J]. Mol Gen Genomics，2006（276）：162-169.

[40] 劉平武，李赟，何慶彪，等.甘藍型油菜pol CMS育性恢復基因的分子標記[J].中國油料作物學報，2007，29（1）：14-19.

[41] TAN X L，VANAVICHIT A，AMORNSILPA S，et al. Genetic analysis of rice CMS-WA fertility restoration based on QTL mapping[J].Theor Appl Genet，1998，97（5-6）：994-999.

[42] 景潤春，何予卿，黃青陽，等.水稻野敗型細胞質雄性不育恢復基因的ISSR和SSLP標記分析[J].中國農業(yè)科學，2000，33（2）：10-15.

[43] 王青山.大豆雄性不育恢復育性相關基因AFLP差異片段的篩選、克隆和SCAR轉換[D].儋州：華南熱帶農業(yè)大學，2006.