李云濤 卜天 曹玉昊 馬劍茵

摘要 [目的] 為海洋抗腫瘤新藥的開發(fā)提供候選藥物。[方法] 以海洋生物蝦蛄為原料，采用胰蛋白酶水解提取蝦蛄軟體組織中的活性多肽，采用超濾、凝膠層析、高效液相色譜等技術(shù)對其進行分離與純化，并選擇高表達腫瘤細胞株進行體外抗腫瘤活性評價。[結(jié)果] 獲得純度較高的活性肽FHOS，此肽的氨基酸序列為Phe Tyr Met Asn His。采用MTT法測得FHOS對PC3細胞和A549細胞的最高增殖抑制率達到70.1%和90.0%，呈現(xiàn)良好的量效和時效關(guān)系。[結(jié)論] FHOS具有一定的抑制腫瘤細胞凋亡的活性。

關(guān)鍵詞 蝦蛄；活性肽；抗腫瘤活性

中圖分類號 S986.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-219-03

蝦蛄（Oratosquilla oratoria），屬于節(jié)肢動物門、軟甲綱、口足目，在我國南北沿海地區(qū)均有分布，是浙江省重要的水產(chǎn)品之一。蝦蛄體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量較高，占總體的16%～20%左右，而生物活性肽就常以非活性形式存在于構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸長鏈中。近年來研究表明，口蝦蛄乙醇提取物能抑制CNE2Z細胞裸鼠移植瘤的生長[1]，降低CNE2Z細胞的體外侵襲能力[2]。酶解法水解提取海洋生物蛋白條件溫和，水解度相對較高，營養(yǎng)成分保留得相對較好，而且從酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)物中分離純化[3]，經(jīng)常會得到一些具有生物活性的肽類化合物。筆者以海洋生物蝦蛄為原料，運用酶解方法和現(xiàn)代分離技術(shù)（膜分離技術(shù)、色譜分離技術(shù)）提取純化蝦蛄多肽，選擇高表達腫瘤細胞株進行體外抗腫瘤活性評價，旨在為海洋抗腫瘤新藥開發(fā)提供候選藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胎牛血清，購自杭州四季青生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT），購自美國SIGMA公司；F12粉末培養(yǎng)基，購自美國SIGMA公司；RPMI1640 培養(yǎng)基，購自Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO），購自美國SIGMA公司。

1.2 試驗儀器

BSZ40LCD 自動部分收集器，為上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；島津PPSQ31A蛋白質(zhì)測序儀，為日本島津公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀Agilent 1200，為美國Agilent公司產(chǎn)品；超濾杯、超濾膜，購自上海摩速科學器材有限公司； G25凝膠分子篩，購自北京亞太恒信生物科技有限公司。FD1000冷凍干燥機，為上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品； CF16RXII高速冷凍離心機，為日本HITACHI公司產(chǎn)品； UV1100紫外分光光度計為上海美譜達公司產(chǎn)品；ZHJHC1209C型超凈工作臺，為上海智誠分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；酶標儀，美國BioRad公司產(chǎn)品； Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱，為美國Thermo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.3 細胞株

人前列腺癌細胞PC3、DU145和肺癌細胞A549，由中國科學院上海細胞生物學細胞庫提供。

1.4 試驗方法

1.4.1 酶解法制備蝦蛄多肽粗提物。

取蝦蛄并粉碎，調(diào)節(jié)pH，在水浴保溫條件下加入一定量的胰蛋白酶酶解，酶解條件為：pH8.36 ，加酶量0.92%，酶解溫度55 ℃， 酶解4 h后將酶解液在100 ℃水浴中滅活15 min，4 000 r/min離心20 min，取上清液濃縮，備用。

1.4.2 MTT法測定抗腫瘤活性[4-5]。

將人前列腺癌細胞DU145、PC3和人肺癌細胞A549分別接種到含有10%胎牛血清和雙抗的F12營養(yǎng)液和RPMI1640營養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取對數(shù)期生長的PC3、DU145、A549細胞，用胰酶消化，制成懸液后接種于96孔板內(nèi)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，貼壁生長至80%左右，然后棄掉營養(yǎng)液，加入供試蝦蛄多肽樣本，每個組設(shè)置3個平行孔，同時設(shè)置不加酶解物的對照組，在5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)一定時間后，每孔分別加入20 μl MTT和180 μl PBS溫育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μl的DMSO，在平板搖床上振蕩10 min，在酶標儀490 nm處測定吸光度，按照以下公式計算細胞增殖抑制率：抑制率=（1-藥物組吸光度值/對照組吸光度值）×100%

1.4.3 蝦蛄酶解多肽的分離與純化。

首先選用超濾法分離，將酶解的粗提物分別用10、5、3 kD超濾膜超濾，分別截留5～10 kD、3～5 kD以及小于3 kD等3個組分，冷凍干燥后分別配成15 mg/ml的濃度，采用MTT法測定各個組分對腫瘤細胞的抑制率。篩選出活性最高的一個組分，選用Sephadex G25凝膠層析，裝柱后用去離子水平衡，組分濃度為100 mg/ml，每次上樣4 ml，洗脫速度為3 ml/min，流動相為去離子水，于280 nm波長處進行紫外檢測。收集洗脫峰，濃縮后冷凍干燥，采用MTT法檢測對 PC3細胞、DU145細胞、A549細胞的增殖抑制率，將活性最高的組分大量收集冷凍干燥進行高效液相色譜分離。高效液相條件為：Zorbax SBC18（4.6×250，5 μm）；柱溫為20 ℃；流動相為水和乙腈；梯度洗脫：0～40 min，乙腈濃度由0%變化到70%；流速： 0.8 ml/min；紫外檢測波長分別為220和280 nm。

1.4.4 多肽的氨基酸序列測定。目標多肽的氨基酸序列分析采用N末端氨基酸降解檢測方法測定。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理。所有試驗數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦蛄酶解多肽的膜分離

將濃縮的酶解液經(jīng)10、5、3 kD的超濾膜粗分離后，得到5～10 kD、3～5 kD以及小于3 kD等3個組分，將各個組分冷凍干燥，配制成15 mg/ml的濃度，反應(yīng)24 h，各組分對PC3細胞的抑制率分別為25.82%、46.75%和67.80%，對DU145細胞的增殖抑制率為39.72%、45.02%和75.54%，其中組分O3對PC3和DU145細胞的抑制作用效果最好（圖1）。

2.2 蝦蛄酶解多肽的凝膠層析分離

經(jīng)過超濾后得到抗腫瘤活性較好的O3組分大量收集，冷凍干燥后選用Sephadex G25凝膠層析洗脫，得到3個組分OS1、OS2、OS3（圖2）。

2.3 凝膠層析組分的抗腫瘤活性研究

將各組分分別配成4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/ml的濃度，采用MTT法檢測其對PC3、DU145、A549腫瘤細胞的增殖抑制率。培養(yǎng)24 h后由于試驗中各組4.0 mg/ml對抗腫瘤細胞的抑制作用較小，所以選為對照組，使用獨立樣本t檢驗分析其他濃度組和該組有無顯著差異。從圖3～5可以看出，3個組分OS1、OS2、OS3對PC3、DU145和A549腫瘤細胞均有一定的抑制性，并且對3種腫瘤細胞的增殖抑制率均呈現(xiàn)出量效關(guān)系，其中OS2的抗腫瘤活性最高。對DU145細胞的抑制率要強于PC3細胞和肺癌A549細胞。當DU145濃度為8.0 mg/ml時，對DU145的抑制率達到83.68%，對PC3細胞的增殖抑制率為70.84%，對肺癌A549細胞的增殖抑制率為67.08%。

2.4 高效液相分離組分的抗腫瘤作用

將上述得到的OS2組分進一步經(jīng)高效液相色譜分離得到3個峰組分，即HOS1、HOS2和HOS3。從圖6可以看出，當濃度為0.4 mg/ml時，培養(yǎng)24 h后，對PC3細胞和DU145細胞的增殖抑制率分別為15.52%、17.96%、16.85%和18.54%、21.02%、20.58%（圖7）。

2.5 FHOS的結(jié)構(gòu)鑒定

從圖8可以看出，組分HOS2對2種腫瘤細胞的增殖抑制作用略強于其他2個組分，將HOS2組分收集并用BEH130 C18色譜柱檢測其純度，在9.81 min出現(xiàn)單一峰，命名為FHOS。經(jīng)檢測該肽的氨基酸序列為Phe Tyr Met Asn His，其分子量為711.80。

2.6 FHOS對PC3細胞和A549細胞的增殖抑制作用

FHOS設(shè)置5個濃度組，分別為3、6、9、12和15.0 mg/ml。分別作用24、48、72 h后，采用MTT法測定對PC3細胞和A549細胞的增殖抑制率。從圖9～10可以看出，作用72 h后FHOS對A549和PC3細胞的增殖抑制率達到70.1%和90.0%。

3 小結(jié)

筆者采用胰蛋白酶水解提取海洋生物蝦蛄軟體組織中的活性多肽，將酶解得到的粗提物進一步采用超濾、凝膠層析、高效液相色譜等技術(shù)進行分離純化，凝膠層析得到3個組分OS1、OS2和OS3，分別將3個組分對PC3細胞、DU145細胞和肺癌A549細胞進行了抗腫瘤活性的研究，表明3個組分對腫瘤細胞均有很好的增殖抑制活性，并且呈現(xiàn)很好的劑量依賴性，對DU145細胞的增殖抑制率最好。然后，再經(jīng)過高效液相色譜分離，最終得到一個活性相對較高的蝦蛄酶解多肽HOS2。在濃度0.4 mg/ml時，對前列腺癌DU145細胞的增殖抑制率為21.02%。將HOS2通過高效液相檢測為單一峰，經(jīng)質(zhì)譜分析和N末端氨基酸降解測序，該組分的氨基酸序列為Phe Tyr Met Asn His，其分子量為711.80，命名為FHOS。采用MTT法測定FHOS對PC3細胞和A549細胞的增殖抑制率，呈現(xiàn)很好的量效和時效關(guān)系。綜上所述，F(xiàn)HOS具有一定的抑制腫瘤細胞凋亡的活性，其體內(nèi)的抗腫瘤作用及其作用機制還有待于深入研究。

參考文獻

[1]

顧帝水，黃培春，孔霞，等.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，14（14）：1825-1826，1828.

[2] 顧帝水，孔霞，黃培春.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的抑制作用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13（21）：2816-2818.

[3] 龔鋼明，顧慧，蔡寶國.魚類加工下腳料的資源化與利用途徑[J].中國資源綜合利用， 2003（7）：23-24.

[4] WU B，ZHU J S，ZHANG Y，et al. Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer：One institutions experience[J].World J Gastroenterol，2008，14（19）：3064-3068.

[5] BURTON J D.The MTT assay to evaluate chemosensitivity[J].Method Mol Med，2005，110（1）：69-78.