HPLC測定大鼠肝組織中多西紫杉醇含量

馬建軍 陳金鳳 嗓曉靜

摘要：目的： 建立高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠肝組織勻漿中多西紫杉醇的方法，考察多西紫杉醇大鼠尾靜脈給藥后肝組織中的濃度。方法： 以紫杉醇為內(nèi)標，大鼠肝組織勻漿樣品中多西紫杉醇經(jīng)萃取后采用SymmetryShield RP18柱（5μm，250×4.6mm）色譜分析柱 ，流動相為乙腈-水（50：50）流速：1.0 ml/min，檢測波長為231nm，進樣量 20u L。大鼠尾靜脈注射給予多西紫杉醇制劑，劑量為75mg/m2。經(jīng)不同時間點解剖動物，用所建立的 HPLC法測定其肝組織中藥物濃度。結(jié)果：紫杉醇和多西紫杉醇的保留時間分別是13.7 min 和11.4 min ， 肝組織樣品中多西紫杉醇在0.986～49.3mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積之間線性關(guān)系良好 ，回歸方程為Y = 1.587213X -5.959293e-002，絕對回收率和相對回收率分別為85%～100%、80% ～115%，日內(nèi) RSD為12.81%、7.17%、3.11% ，日間RSD為10.61% 、3.5%、9.38% ， 且穩(wěn)定性良好。實測得多西紫杉醇在大鼠肝組織中的濃度為177.7～3904.3μg/g。結(jié)論：本試驗建立的方法簡便靈敏 ，干擾小 ，重復性好 ，可實際應用于多西紫杉醇在大鼠肝組織中的測定 ，并作為評價多西紫杉醇在靶組織分布的方法學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：多西紫杉醇； 肝組織； 高效液相色譜法

Abstract：Objective to establish HPLC method for determination of docetaxel in rat liver tissue，and to investigation the docetaxel concentration in rat liver tissue after intravenous administration .METHODS Taxol was used as internal standard. The docetaxel was extracted for two times determined through SymmetryShield RP18 column （5μm，250*4.6mn） chromatography column .The mobile phase consisted of water-acetonitrile （50：50） with the flow rates of 1.0ml/min.The detection wavelength was 231nm. Docetaxel was intravenously administrated to rat at a single dosage of 75mg/㎡.The rat were dissectted at different time points and docetaxel of hepatic tissue was determined by HPLC.RESULTS In this system，the retention times of Taxol and docetaxel were 13.7 min and 11.4min ，respectively. Docetaxel concentration presented a good linear range of 0.986～49.3mg/L.The linear regression equation Y = 1.587213X -5.959293e-002.Absolute recovery and relative recoveries were 85%to100%，80%to115%.Within-day RSDs were 12.81%、7.17%、3.11%，and the between-day RSDs were 10.61%、3. 5%、9.38%.The concentration of Docetaxel in rat liver tissue were177.7～3904.3μg/g.CONCLUSION The method is reliable ，convenient and efficient and can be applied to the determination of docetaxel concentration of rat hepatic tissue in the tissue distribution research of docetaxel.

KEYWORDS： docetaxel； hepatic tissue； HPLC

多西紫杉醇 （docetaxel ，Doc ，又名多西他賽） 是新一代紫杉烷類抗腫瘤藥物。商品名為 taxotere （泰索帝） [1]。由于多西紫杉醇以t-丁氧羰基取代了紫杉醇中的苯甲酸基團，因而水溶性略大于紫杉醇。市售制劑泰索帝（Taxotere）采用Tween80增溶、乙醇助溶，將其制成一個注射劑濃縮液和一個溶劑的兩瓶裝。其中注射劑濃縮液為含有主藥的Tween80溶液，溶劑為13%（w/w）的注射乙醇，使用時先將溶劑加入濃縮液中混合均勻，臨用前再用生理鹽水或5%葡萄糖注射液稀釋后使用。這種使用方法操作繁瑣，臨床用藥極不方便，并且在配制過程中容易產(chǎn)生二次污染，給患者的使用帶來風險。為了消除現(xiàn)有多西紫杉醇制劑所產(chǎn)生的一系列問題并解決多西紫杉醇溶解度低的缺點，本課題研制了多西紫杉醇靜脈注射亞微乳，以期為多西紫杉醇的新劑型開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外對于多西紫杉醇在生物標本中的分析方法多采用液相色譜或液-質(zhì)聯(lián)用檢測法。本試驗采用高效液相色譜法測定大鼠肝組織中的多西紫杉醇，操作簡便 [3]。

1 材料

1.1儀器

KUBOTA5922型冷凍離心機，島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀BP221S型電子分析天平，N-EVAP型氮吹儀，XW-80A旋渦混旋機，Cascada IX型超純水儀，ETS-2型大容量高速勻漿機

1.2試劑

甲醇（Fisher 公司）、叔丁基甲醚（CNW Technologiers Gmbh公司）、生理鹽水、乙腈（HPLC級，F(xiàn)isher Scientific 公司）、純化水（自制）、氮氣

1.3 試藥

紫杉醇對照品 （中國藥品生物制品檢定所。批號：100382-200301），（中國藥品生物制品檢定所。批號：100666-200401，含量99.3%） ， 多西他賽亞微乳注射液（批號：20100204）

1.4 實驗動物

SD大鼠，雌雄兼用，體重180-220g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（湘）2006-0001。試驗前12h禁食，隨意飲水

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SymmetryShield RP18柱（5um，250×4.6mm）； 檢測波長：231nm，柱溫：30℃；流動相：乙腈：水=50：50；流速：1.0ml/min；進樣量：20μL.

2.2 標準儲備液配制

2.2.1 多西紫杉醇標準儲備液

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥兩小時的多西紫杉醇標準品適量，精密稱定0.04930g，置于經(jīng)干燥的100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用超聲儀超聲五分鐘使其完全溶解并混勻，即得0.493mg/mL多烯紫杉醇標準溶液。量取1ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得49.3μg/mL多烯紫杉醇標準品。

2.2.2 紫杉醇內(nèi)標溶液

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥三小時的紫杉醇對照品適量，精密稱定0.00813g，置于經(jīng)干燥的100ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.0813mg/ml紫杉醇內(nèi)標溶液

2.3 組織樣品處理

2.3.1 組織勻漿

解剖大鼠，取肝臟組織 ，生理鹽水洗凈至無血色 ，濾紙吸干 ，稱取肝組織樣品0.3g，加入0.9%生理鹽水0.9ml勻漿，直至肝組織形成勻漿，將其轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，備用。

2.3.2組織樣品中多西紫杉醇的提取

采用叔丁基甲醚2次提取組織中的多西紫杉醇。量取2.7ml叔丁基甲醚分次沖洗裝勻漿液的玻璃管，將沖洗液轉(zhuǎn)移至相應的離心管中，渦旋震蕩3min，3000r/min離心10min，用滴管移取上清液至另一只10ml玻璃離心管中，同法用叔丁基甲醚再提取一次，合并兩次提取液，室溫下氮氣流吹干，加入0.3ml甲醇，渦旋震蕩3min，用0.45um有機濾膜過濾，制成樣品以待進樣。

2.4 采樣方法及采樣時間點選擇

2.4.1采樣方法

SD大鼠，雌雄各半，禁食12h后尾靜脈注射多西紫杉醇亞微乳注射液75mg/m2 ，給藥后不同時間點5min、30min、1h、3h、5h、7h脫頸椎處死，取完整肝，用生理鹽水洗凈，然后用濾紙吸干，包于錫箔紙內(nèi)，置-40℃冰箱內(nèi)保存，待用。

2.4.2采樣時間點的選擇

分別在給藥后5min、30min、1h、3h、5h、7h處死給藥大鼠雌雄各一只，取肝組織，按供試樣品處理方法處理，HPLC進樣20μL分析，以多西紫杉醇峰面積為縱坐標、采樣時間為橫坐標作圖，結(jié)果見圖1

圖1不同采樣時間—多西紫杉醇峰面積曲線

Fig.1 Sampling time - docetaxel peak area under the curve

通過以上試驗結(jié)果，選擇采樣點5min作為吸收相代表，30min、1h作為平衡相代表，5h作為消除相代表。

2.5 專屬性試驗

空白組織樣品、空白肝組織勻漿中加入紫杉醇對照品、空白肝組織勻漿中加入多西紫杉醇對照品、給藥后大鼠肝組織樣品色譜圖見圖。由圖可見 ，在所建立的色譜條件下 ，肝組織勻漿液中成分不干擾多西紫杉醇與內(nèi)標紫杉醇的測定。多西紫杉醇與內(nèi)標紫杉醇分離良好，保留時間分別為11.4min、13.7min左右。

2.6標準曲線繪制

取6只空白大鼠肝組織勻漿液 6 管 ，每管中均加入多西紫杉醇標準儲備液和內(nèi)標紫杉醇標準儲備液 將肝組織勻漿稀釋成多西紫杉醇系列質(zhì)量濃度為0.986 mg/L、4.930 mg/L、9.860 mg/L、16.433 mg/L、32.867 mg/L、98.600 mg/L，每管均加入內(nèi)標紫杉醇標準儲備液 50μL，作為標準曲線溶液 ，按“2. 3” 方法處理樣品并測定，以多西紫杉醇與紫杉醇峰面積比為橫坐標（X），多西紫杉醇與紫杉醇濃度比為縱坐標（Y），1/C2為加權(quán)系數(shù)進行線性回歸，得肝組織標準曲線方程，結(jié)果Y = 1.549142X-3.502753e-002 R2 = 0.9985

2.7 精密度與相對回收率試驗

取空白肝組織0.3g勻漿 ， 各加入不同體積的多西紫杉醇標準儲備液和相同體積的內(nèi)標紫杉醇溶液，分別配成多西紫杉醇質(zhì)量濃度為0.986，4.93，49.3 mg/L低、中、高 3 個濃度含藥組織勻漿各6份樣品。按前述組織樣品處理方法處理，進樣20ul，連續(xù)進樣三天。由標準曲線計算各樣品的的濃度，以測定值與實際值之比計算相對回收率、日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表1

表1肝組織中多西紫杉醇精密度試驗 （n=6）

Table 1 docetaxel precision of liver tissue （n = 6）

2.8 提取回收率試驗

取空白肝組織0.3g勻漿 ， 各加入不同體積的多西紫杉醇標準儲備液和內(nèi)標紫杉醇溶液，分別配成含藥組織勻漿樣品。按樣品處理方法平行處理，使供試樣品多西紫杉醇質(zhì)量濃度為0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 個濃度各6份，進樣20μL分析，記錄多西紫杉醇峰、紫杉醇面積A1、B1，另取不同體積的多西紫杉醇標準溶液分別加入生理鹽水0.9ml，按樣品處理方法平行處理，使供試樣品多西紫杉醇質(zhì)量濃度為0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 個濃度各6份，進樣20μL分析，記錄多西紫杉醇、紫杉醇峰面積A2、B2。以R=A1/A2×100%計算肝組織中多西紫杉醇的提取回收率R，同法計算紫杉醇提取回收率。結(jié)果見表2

2.9 穩(wěn)定性試驗

2.9.1 室溫放置24h穩(wěn)定性考察 取空白肝組織0.3g勻漿 ， 各加入不同體積的多西紫杉醇標準儲備液和內(nèi)標紫杉醇溶液，分別配成含藥組織勻漿樣品。按樣品處理方法平行處理，使供試樣品多西紫杉醇質(zhì)量濃度為0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 個濃度各6份。室溫放置24h后，進樣分析，實測濃度的RSD值分別為5.70%、2.18%、4.70%，證明供試樣品24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9.2 凍融3個循環(huán)后穩(wěn)定性考察 取空白肝組織0.3g勻漿 ， 各加入不同體積的多西紫杉醇標準儲備液和內(nèi)標紫杉醇溶液，分別配成含藥組織勻漿樣品。使供試樣品多西紫杉醇質(zhì)量濃度為0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 個濃度各6份。各樣品中加入內(nèi)標溶液50ul，置-40℃冰箱內(nèi)放置，反復凍融三次，按前述組織樣品處理和測定方法操作，計算其濃度 ， 結(jié)果其RSD 值為11.92%、7.54%、9.86%，證明樣品凍融3各循環(huán)后是穩(wěn)定的。

2.10 大鼠肝組織中藥物濃度

2.10.1 給藥方法

大鼠尾靜脈注射給予多西紫杉醇亞微乳，劑量為75mg/m2 ，給藥前禁食，自由飲水，分別于給藥后5min、30min、1h、5h處死動物，解剖后取肝組織待測。

2.10.2 給藥5min、30min、1h、5h后肝組織中多西紫杉醇濃度

為驗證本試驗所建立的肝組織勻漿中多西紫杉醇濃度測定方法是否可實際應用于測定大鼠尾靜脈給藥后分布至肝臟中的藥物 ， 因此分別取給藥5min、30min、1h、5h 后 大鼠肝組織，制成勻漿，按前述組織樣品處理和測定方法操作，測定其中多西紫杉醇質(zhì)量濃度為，結(jié)果如下表

表3 樣品含量測定（n=6）

Table 3 content of the sample was measured （n = 6）

3.討論

對于生物樣本中多西紫杉醇的檢測 ， 有文獻報道流動相采用0.02 mol/L 醋酸銨溶液 （pH 4.5）乙腈 （60∶40 ）或磷酸鹽緩沖液 （30 mmol/L ，pH3） 乙腈 （47∶53）。亦有文獻報道采用別的流動相，但不利于內(nèi)標紫杉醇和多西紫杉醇的分離。流動相中有機溶劑乙腈容積比例的增減對多西紫杉醇的保留時間有較大的影響[6]。 本試驗采用乙腈-水（50∶50） 作為流動相 ， 可使內(nèi)標紫杉醇和多西紫杉醇的保留時間分別在11.4min 和 13.7min 左右 ，分離較為理想。

內(nèi)標物的選擇 ， 由于紫杉醇與多西紫杉醇的出峰位置相近且能分離良好 ，對測定沒有干擾 ， 且紫杉醇的水溶液在-40 ℃冰箱中放置較長時間亦很穩(wěn)定 ，所以用紫杉醇作為內(nèi)標穩(wěn)定、可靠。

本試驗采用叔丁基甲醚提取肝組織勻漿中多西紫杉醇 ，快速混合 2 次提取 ，能有效提取多西紫杉醇并減少了其他物質(zhì)干擾 ，提取回收率較高 ，基線平穩(wěn) ，雜質(zhì)峰少 ，分析時間適中。

多西紫杉醇屬強親脂性物質(zhì) ，在水中溶解度極低 ，在甲醇、乙腈等有機溶劑中溶解較好 ，但室溫和光線會加速其分解 ，因此其提取需在避光條件下進行 ，低溫冷凍可保存較長時間。

由大鼠尾靜脈給予多西紫杉醇經(jīng)不同時間段測定分布至肝臟中的藥物濃度結(jié)果表明：本試驗所建立的方法學可用于藥物在動物肝組織中的測定 。

參考文獻：

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