李寧等

摘要：目的： 研究高良姜提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞、人胰腺癌Capam-2細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞株的增殖抑制作用。方法：采用 MTT法檢測(cè)不同劑量的高良姜氯仿提取物、正丁醇提取物及水提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響，比較三種提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制效果并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。結(jié)果：高良姜不同提取物可呈不同程度地劑量依賴性抑制HepG2、Capam-2和Hela細(xì)胞株增殖，其中高良姜氯仿提取物抑制各腫瘤細(xì)胞的IC50明顯低于高良姜正丁醇提取物和水提取物，說(shuō)明氯仿提取物相比其余兩種提取物抗的腫瘤活性高。結(jié)論：高良姜不同提取物能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，其氯仿提取物抗腫瘤作用更為明顯。

關(guān)鍵詞：高良姜；提取物；抗腫瘤

高良姜，別名小良姜，為姜科植物，是一種熱帶多年生長(zhǎng)的山姜屬食藥兼用的植物，在我國(guó)古代的諸多藥典如《本草綱目》和《圖經(jīng)本草》均有記載。高良姜主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、海南等省，廣東湛江徐聞縣是我國(guó)高良姜最集中的產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量占全國(guó)90%以上，素有"高良姜之鄉(xiāng)"之美稱[1]。高良姜主要含黃酮類化合物、二苯基庚烷類、揮發(fā)油，還含有糖苷、苯丙素、甾醇類、微量元素等，目前仍不斷分離鑒定其更多化合物[2]。高良姜化學(xué)成分復(fù)雜，藥理活性強(qiáng)，有較強(qiáng)的抗氧化、降血糖、抗?jié)?、止嘔抗腹瀉、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血、抗血栓形成、抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)滲透性等藥理作用[3，4]。本文實(shí)驗(yàn)研究了高良姜不同提取物體外抗腫瘤細(xì)胞株增殖的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高良姜不同提取物（水提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物）為廣東醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室提供；RPMI1640、胰酶（美國(guó)GIBCO公司），超級(jí)無(wú)支原體FBS（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó)Sigma公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；人肝癌HepG2細(xì)胞、人胰腺癌capam-2細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞（保存于廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液疾病研究室）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞、人胰腺癌capam-2細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞三種人源腫瘤細(xì)胞株均用含10% 胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2飽和濕度的二氧化碳孵箱中連續(xù)培養(yǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測(cè)高良姜提取物對(duì)三種癌細(xì)胞株增殖能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同腫瘤細(xì)胞株，接種4000/孔細(xì)胞懸液于96孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入含不同濃度的高良姜揮發(fā)油藥液（100、200、400、600、800μg/mL）處理，同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑對(duì)照組，每一濃度設(shè)4個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT （5 g/L） 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入DMSO 150 μL。在微型振蕩器上避光振蕩20 min，結(jié)晶完全溶解后，立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570 nm檢測(cè)OD值，以空白孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%） =加藥孔平均OD值/對(duì)照孔平均OD值×100%，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（ IC50 ）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1 高良姜水提取物對(duì)三種人腫瘤細(xì)胞株的增殖的抑制作用

結(jié)果顯示高良姜水提取物可呈劑量依賴性抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對(duì)Hela細(xì)胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明顯，見圖1。

圖1 高良姜水提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2 高良姜正丁醇提取物對(duì)三種人腫瘤細(xì)胞株的增殖的抑制作用

結(jié)果顯示高良姜水提取物可呈劑量依賴性抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對(duì)Hela細(xì)胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明顯，見圖2。

圖2 高良姜正丁醇提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.3 高良姜氯仿提取物對(duì)三種人腫瘤細(xì)胞株的增殖的抑制作用

結(jié)果顯示高良姜水提取物可呈劑量依賴性抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對(duì)HepG2細(xì)胞株比Hela、Capam-2的抑制效果更明顯，見圖3。

圖3 高良姜氯仿提取物對(duì)對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.4 高良姜不同提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的IC50比較

結(jié)果顯示高良姜氯仿提取物抑制不同腫瘤細(xì)胞的IC50明顯低于高良姜正丁醇提取物和水提取物，可見其比這兩種提取物抗腫瘤活性高，可說(shuō)明高良姜抗腫瘤活性成分存在于氯仿提取物中，主要為非極性物質(zhì)。

圖4 不同高良姜提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞IC50的影響

3.討論

中藥資源豐富，從中藥中尋找抗癌活性成分是很好的藥物前體或新藥開發(fā)途徑[5]。高良姜作為中藥材原料豐富，價(jià)格相對(duì)便宜，可食藥兼用，毒副作用小。在醫(yī)學(xué)上有幫助消化、健胃及治療凍瘡、灼傷、驅(qū)蚊殺菌等用途，高良姜除藥用外還大量用作調(diào)味料，是多種食品的重要原料，還可用于制造保健飲料和日常護(hù)理品。目前高良姜中黃酮類化合物抗腫瘤作用研究逐漸備受關(guān)注。Lu等[6]的研究表明，高良姜總黃酮和高良姜素能明顯抑制B16大鼠黑色素瘤細(xì)胞中黑色素的合成，防止皮膚癌發(fā)生。Moon等[7]研究顯示高良姜素能有效降低甲基亞硝基脲對(duì)小鼠肺細(xì)胞染色體的致畸作用，并且其提取物能抑制7，12-二甲基苯并蒽引起的小鼠細(xì)胞畸變作用。而對(duì)于促癌物質(zhì)TPA誘發(fā)的小鼠耳部水腫，高良姜的甲醇提取物表現(xiàn)出明顯抑制作用[8]。高良姜提取物能有效增加人結(jié)腸癌CaCo-2細(xì)胞滲透性并降低上皮細(xì)胞的電阻[9]。?；盏萚10]發(fā)現(xiàn)高良姜藥材中的槲皮素等成分能對(duì)HL-60細(xì)胞株的增殖有抑制作用。最近研究顯示，高良姜素抑制人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)[11]，抑制缺氧誘導(dǎo)肺癌NCI-H157細(xì)胞合成血管生長(zhǎng)因子。我們課題組研究發(fā)現(xiàn)高良姜揮發(fā)油能抑制多種實(shí)體瘤癌細(xì)胞的增殖[12]，高良姜素抑制多種肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13] 。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示高良姜水提取物、正丁醇提取物和氯仿提取物能呈劑量依賴性抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖，且其抗腫瘤活性與提取溶劑的極性成反比，即提取溶劑的極性越小其提取出的物質(zhì)成分的抗腫瘤活性更強(qiáng)，說(shuō)明有效抗腫瘤成分主要是非極性成分。研究開發(fā)道地南藥高良姜抗腫瘤有效成分，將擴(kuò)大高良姜的應(yīng)用范圍增加其附加值，將具有良好的市場(chǎng)前景和提高當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)效益，應(yīng)需加以開發(fā)深入研究。