施琬，黃惠珠，李鐘，胡旭光，韓彬

廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

建立高尿酸血癥動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究

施琬，黃惠珠，李鐘，胡旭光，韓彬

廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

目的：探討構(gòu)建科學(xué)、合理、穩(wěn)定的高尿酸血癥動(dòng)物模型，為治療高尿酸血癥藥物藥效及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用次黃嘌呤、氧嗪酸鉀和乙胺丁醇三者聯(lián)合應(yīng)用造模。模型Ⅰ組采用次黃嘌呤（25 g/kg）飼料喂養(yǎng)，乙胺丁醇（250mg/kg）灌胃并同時(shí)皮下注射氧嗪酸鉀（200mg/kg）；模型Ⅱ組灌胃給予腺嘌呤（100mg/kg）和乙胺丁醇（250mg/kg）。連續(xù)檢測(cè)大鼠血清中血尿酸水平，并進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)觀察，綜合評(píng)價(jià)其對(duì)腎臟的影響。結(jié)果：模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠連續(xù)給藥10天后，其血尿酸水平均明顯升高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型Ⅰ組在造模的第3、7天的給藥后3h血清尿酸值已明顯升高，12～24 h與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模后模型Ⅰ、Ⅱ組的尿素氮與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2組模型動(dòng)物血清肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與空白對(duì)照組比較無(wú)差異。模型Ⅰ組腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度積分均低于模型Ⅱ組（P＜0.05）。結(jié)論：兩種造模方法均能有效造模，模型Ⅰ組更適合于高尿酸血癥治療藥物藥效篩選及作用機(jī)制的研究。

高尿酸血癥；次黃嘌呤；氧嗪酸鉀；乙胺丁醇；動(dòng)物模型；大鼠

痛風(fēng)是由于長(zhǎng)期嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起的常見(jiàn)代謝性疾病，臨床上首先表現(xiàn)為高尿酸血癥，其診斷標(biāo)準(zhǔn)定義為血尿酸水平男性＞420μm ol/L，女性＞357μm ol/L，其主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石、痛風(fēng)性腎病，嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，有些患者還可伴發(fā)高脂血癥、糖尿病、高血壓病及心腦血管?。?～2］。

復(fù)制大鼠持續(xù)性高尿酸血癥模型的意義主要是為了研究治療高尿酸血癥藥物的藥效和作用機(jī)制，現(xiàn)有造模方法雖可使大鼠血尿酸較快升高，但高尿酸水平維持時(shí)間較短，很難觀察到藥物降尿酸的全程作用以及用于作用機(jī)制的研究，且大部分實(shí)驗(yàn)顯示大鼠腎臟損害出現(xiàn)早并且較重，與人類發(fā)病過(guò)程不符。故目前尚缺乏理想的大鼠持續(xù)性高尿酸血癥動(dòng)物模型［3～4］，從而對(duì)該類藥物的研究帶來(lái)很大影響，故積極摸索造模方法具有重要意義。

目前，制作高尿酸血癥動(dòng)物模型給藥類型主要有3種：①促進(jìn)尿酸生成增多，如補(bǔ)充尿酸、酵母、腺嘌呤、次黃嘌呤；②抑制尿酸分解，如給予氧嗪酸鉀；③抑制尿酸排泄：如灌胃乙胺丁醇。本實(shí)驗(yàn)擬采取含次黃嘌呤飼料喂飼、皮下注射氧嗪酸鉀和灌胃乙胺丁醇3種藥物聯(lián)合造模，與腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇造模做比較，觀察受試動(dòng)物大鼠血清尿酸值的變化，以探討3種藥物作用下，復(fù)制大鼠高尿酸模型的可行性。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。

1.2 試劑與儀器 鹽酸乙胺丁醇片（生產(chǎn)批號(hào)：130102），廣州白云山明興制藥有限公司；腺嘌呤（生產(chǎn)批號(hào)：ZXRYE-TP），梯希愛(ài)（上海）工業(yè)發(fā)展有限公司；次黃嘌呤（生產(chǎn)批號(hào)：ZY131028），上海紫一試劑廠；氧嗪酸鉀（生產(chǎn)批號(hào)：131015）瀚渤（上海）貿(mào)易有限公司；肌酐試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20140108），谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20140106），尿素氮試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20140108），尿酸試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20131217），南京建成生物工程研究所；德國(guó)sigm a高速離心機(jī)；AMS-18自動(dòng)生化分析儀，北京奧普森生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物配制 飼料制作：用打粉機(jī)將正常飼料粉碎成粉末后加入次黃嘌呤攪拌均勻，取出加入滅菌蒸餾水和好，用50 m L針筒擠出圓柱狀飼料。放入烘箱烘干至飼料中殘留水分揮發(fā)即可。鹽酸乙胺丁醇配制：將藥片壓碎，加蒸滅菌餾水溶解、混勻，配成25m g/m L。氧嗪酸鉀鹽配制：干粉研磨約至細(xì)粉后，滴加入橄欖油研磨，可保存2～3天。

2.2 動(dòng)物分組及處理 將雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型Ⅰ、Ⅱ組，共3組，每組10只。大鼠均單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前24 h開(kāi)始喂飼飼料，模型Ⅰ組飼料中含次黃嘌呤25 g/kg，正常對(duì)照組和模型Ⅱ組給予正常飼料，連續(xù)喂飼。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，記錄大鼠12 h的攝食量。模型Ⅰ組灌胃給予乙胺丁醇250m g/kg，給藥體積為10m L/kg，同時(shí)皮下注射氧嗪酸鉀200m g/kg，給藥體積為0.5m L/kg；模型Ⅱ組灌胃給予腺嘌呤100m g/kg和乙胺丁醇250m g/kg制備而成的混懸液，給藥體積為10m l/kg。連續(xù)10天。

2.3 血尿酸測(cè)定 造模前1天，于各組大鼠眼眶后靜脈叢取血置于1.5 m L離心管中，收集的血液樣品常溫放置3 h，4000 rpm/m in離心15m in，得血清。模型Ⅰ組于開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的第3和7天皮下注射氧嗪酸鉀后的第3、6、12、24 h于大鼠眼眶后靜脈叢取血置于1.5m L離心管中，收集的血液樣品常溫放置3 h。4000 rpm/m in，半徑10 cm離心15m in，得血清。實(shí)驗(yàn)第10天給藥后第6 h于各組大鼠眼眶后靜脈叢取血處死前采血置于5m L離心管中，所收集的血液樣品常溫放置3 h。4000 rpm/m in離心15m in，得血清。各批次血清樣本均使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿酸。

2.4 腎臟病理及損害程度的判斷 造模第10天給藥后6 h處死各組大鼠，沿腹中線逐層剪開(kāi)腹膜，推開(kāi)內(nèi)臟組織，找到腎臟，剪開(kāi)腎包膜，觀察腎臟肉眼改變，組織標(biāo)本置于10%中性福爾馬林緩沖液中保存固定48 h后，用石蠟包埋機(jī)常規(guī)包埋，行切片及HE染色。腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度的判斷：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野測(cè)定，計(jì)算病變面積與同視野腎皮質(zhì)總面積的百分比，按以下方法換算為分?jǐn)?shù)后取平均值。腎小管間質(zhì)炎癥程度半定量評(píng)分法：0分，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)＜25%；2分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)25%～49%；3分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)50%～75%；4分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)＞75%。腎小管病變的評(píng)分觀察指標(biāo)包括以下2個(gè)方面：腎小管變性、壞死；腎小管擴(kuò)張、萎縮。按病變程度與范圍進(jìn)行半定量評(píng)分：0分，無(wú)小管病變；1分，病變小管面積＜10%；2分，病變小管面積10%～25%；3分，病變小管面積26%～75%；4分，病變小管面積＞75%。以上結(jié)果的判讀采用盲法進(jìn)行，由2名與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的病理研究員實(shí)施［5］。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s）表示，分級(jí)組間多重比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)與秩變換分析方法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組血尿酸值比較 見(jiàn)表1、表2。模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠連續(xù)給藥10天后，其血尿酸水平均明顯升高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型Ⅰ組在造模的第3和7天的給藥后3 h血清尿酸值已明顯升高，到12 h時(shí)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），到24 h時(shí)的尿酸值雖然下降，但亦高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 各組造模前后血尿酸值比較±s） μmol/L

表1 各組造模前后血尿酸值比較±s） μmol/L

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組n 8 8 8造模前95.63±7.09 100.63±8.58 98.25±9.24造模后96.63±12.49 381.75±61.75①235.25±24.20①

表2 2組造模第3和7天血尿酸值比較±s） μmol/L

表2 2組造模第3和7天血尿酸值比較±s） μmol/L

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05

采血時(shí)間點(diǎn)3 h 6 h 12 h 24 h空白對(duì)照組95.36±12.60 97.20±12.56 96.28±11.32 96.63±12.49模型Ⅰ組第3天485.13±116.60①531.63±188.03①402.25±84.47①159.38±54.40①第7天483.13±78.81①422.50±94.39①365.38±94.39①218.75±57.68①

3.2 各組尿素氮、肌酐、轉(zhuǎn)氨酶變化比較 見(jiàn)表3。造模后模型Ⅰ、Ⅱ組的尿素氮與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2組模型動(dòng)物血清肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與空白對(duì)照組比較無(wú)差異。

表3 各組尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶變化比較±s）μmol/L

表3 各組尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶變化比較±s）μmol/L

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組n 8 8 8尿素氮3.04±0.51 6.2±0.72①8.14±2.1①肌酐54.5±15.59 59.5±6.95 60.38±15.55谷丙轉(zhuǎn)氨酶20.25±6.14 23.75±4.33 23.25±6.69

3.3 各組腎臟病理改變及損害程度比較 見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、表4、表5?？瞻讓?duì)照組大鼠腎單位結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊。髓質(zhì)集合管管腔規(guī)則。模型Ⅰ組腎小球病變不明顯，單位組織結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)小血管輕微充血，腎小管管腔呈不規(guī)則形，部分上皮細(xì)胞水腫，胞漿淡染。腎髓質(zhì)由大量密集平行排列的集合管組成，集合管管腔較大，披覆單層立方或柱狀上皮，核圓居中，胞漿染色淡，無(wú)明顯病變。模型Ⅱ組腎小球未見(jiàn)明顯病變，腎小管病變較嚴(yán)重，部分上皮細(xì)胞變扁平，部分腎小管內(nèi)可見(jiàn)炎細(xì)胞聚集，腎間質(zhì)水腫，伴中量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。腎髓質(zhì)集合管內(nèi)可見(jiàn)白細(xì)胞管型。模型Ⅰ組腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度積分均低于模型Ⅱ組（P＜0.05）。

4 討論

大鼠高尿酸血癥模型的建立，自2001年熊湘明等［6］以灌胃腺嘌呤100m g/kg和乙胺丁醇250m g/kg取得成功后，該方法得到廣泛應(yīng)用。而徐立等［7］以喂飼含次黃嘌呤50 g/kg的飼料和皮下注射尿酸酶抑制劑200m g/kg，陳光亮等［8］則以皮下注射氧嗪酸鉀200m g/kg和灌胃乙胺丁醇250m g/kg，也都成功建立。

高尿酸血癥的相對(duì)穩(wěn)定和維持一直是此類模型制作過(guò)程中的難點(diǎn)，既往研究表明，連續(xù)給予造模劑各組大鼠血清尿酸值變化與單次給予造模劑不同，后者僅可使受試動(dòng)物血清尿酸值短暫升高，維持時(shí)間約12 h。而連續(xù)給予造模劑可使受試動(dòng)物血清尿酸值持續(xù)升高，并可在給予造模劑時(shí)段內(nèi)始終維持在較高水平。根據(jù)既往報(bào)道，若一次性灌胃給予次黃嘌呤500m g/kg和尿酸酶抑制劑50m g/kg，大鼠血尿酸在造模后3、6、9 h均高于正常水平，但12 h后基本降至正常水平［9］；若每12 h給予次黃嘌呤500m g/kg灌胃，同時(shí)皮下注射尿酸酶抑制劑200m g/kg，大鼠血尿酸不斷升高，但出現(xiàn)了動(dòng)物死亡，可能是尿酸沉積于腎組織導(dǎo)致腎臟嚴(yán)重?fù)p傷［10］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ廷窠M采用尿酸前體物的次黃嘌呤、抑制尿酸排泄的乙胺丁醇和抑制尿酸酶活性的氧嗪酸鉀，三藥聯(lián)用造模，在造模的24 h內(nèi)，大鼠的血尿酸明顯高于正常值，但波動(dòng)較大，特別是12 h以后，血尿酸值下降，但仍可維持在空白對(duì)照組的1倍以上，且無(wú)動(dòng)物死亡。

圖1 空白對(duì)照組腎小管（×400）

圖2 空白對(duì)照組腎髓質(zhì)（×200）

圖3 模型Ⅰ組腎小管（×400）

圖4 模型Ⅰ組腎髓質(zhì)（×200）

圖5 模型Ⅱ組腎小管（×400）

圖6 模型Ⅱ組腎髓質(zhì)（×200）

表4 各組大鼠腎臟病理改變?cè)u(píng)分分級(jí)（n＝8）

表5 各組腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度積分比較±s，n＝8）

表5 各組腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度積分比較±s，n＝8）

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型Ⅱ組比較，②P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組炎細(xì)胞浸潤(rùn)0.00±0.00 1.40±0.55①②2.83±0.41①腎小管損傷0.00±0.00 2.20±0.45①②3.17±0.41①總積分0.00±0.00 3.60±0.89①②6.00±0.63①

次黃嘌呤為人體生成尿酸的前體物質(zhì)，加上皮下注射尿酸酶抑制劑抑制尿酸分解，乙胺丁醇抑制尿酸排泄，可使尿酸在體內(nèi)蓄積，從而增加血尿酸水平，并可以維持較長(zhǎng)時(shí)間的高尿酸水平，如給予合理的劑量，可以造成長(zhǎng)期高尿酸血癥的大鼠模型，但其中關(guān)鍵是給予次黃嘌呤的方法，若在藥效實(shí)驗(yàn)時(shí)再增加灌胃給藥環(huán)節(jié)，則可能會(huì)增加動(dòng)物的死亡率。

造模過(guò)程中對(duì)腎臟的影響也一直是需要特別關(guān)注的問(wèn)題。既要考慮造模藥物自身對(duì)腎臟的作用，而過(guò)高的尿酸血癥本身也會(huì)引起急性尿酸性腎病。從圖5和圖6可以看到，模型Ⅱ組腎小管病變較嚴(yán)重，腎小球雖未見(jiàn)明顯病變，但尿素氮與空白對(duì)照組比較差異顯著。腺嘌呤本身就可導(dǎo)致大鼠慢性腎功能衰竭［11］，其造模引起的腎臟病變也并非全因高尿酸血癥引發(fā)，故不宜作為理想的高尿酸血癥模型藥物。

本實(shí)驗(yàn)采用尿酸前體物質(zhì)，尿酸排泄抑制劑和尿酸酶活性抑制劑三者聯(lián)合應(yīng)用造模，較好的模擬了人體尿酸代謝異常的過(guò)程，且可以保證在整個(gè)過(guò)程中高尿酸血癥持續(xù)維持，適合于高尿酸血癥治療藥物藥效及作用機(jī)制的篩選，此為本次實(shí)驗(yàn)的突出創(chuàng)新點(diǎn)。若需建立穩(wěn)定持續(xù)、長(zhǎng)期可用的高尿酸血癥大鼠模型，可考慮適量減少飼料中次黃嘌呤量，使動(dòng)物血尿酸值升高控制在更為合理及安全的水平上。由于人類在進(jìn)化過(guò)程中，編碼尿酸酶的基因發(fā)生了突變，尿酸酶缺乏，而大鼠體內(nèi)尿酸酶的存在，使其造模較為困難［12］，建立更合乎人類發(fā)病機(jī)制、與人體尿酸代謝異常相似的動(dòng)物模型，仍需繼續(xù)探索，目前可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件及研究需要選擇合適的動(dòng)物及造模方法。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R589.7

A

0256-7415（2015）06-0273-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.128

2014-12-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173194）

施琬（1990-），男，在讀碩士研究生。

韓彬，E-mail：hblz99@21cn.com。