李博，謝樹蓮

（1.太原師范學(xué)院 地理科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030012；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

地衣中共生藻的光合作用為地衣體制造有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，而共生菌則吸收環(huán)境中的水分和無機(jī)鹽為共生藻的光合作用提供原料。目前已報(bào)道的地衣共生藻約有40屬120種，主要分布于是藍(lán)藻和綠藻。Honegger［1］指出地衣共生藻在受到外界環(huán)境劇烈變化時(shí)（如低溫、干旱等），其原生質(zhì)體會(huì)大幅收縮，從而促使地衣體進(jìn)入生理休眠狀態(tài)，反之，當(dāng)外界環(huán)境有利于地衣體生長(zhǎng)時(shí)，其生理活動(dòng)也能迅速恢復(fù)。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，逐漸產(chǎn)生了一系列適應(yīng)低溫變化以增強(qiáng)其抗寒性的能力。當(dāng)植物遭受低溫傷害時(shí)，其自身會(huì)合成或分解形成一些小分子物質(zhì)，增加細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，緩解或降低低溫所造成的傷害［2］。此外，低溫脅迫會(huì)影響活性氧的產(chǎn)生與清除，造成氧化脅迫，進(jìn)而引起細(xì)胞膜脂過氧化、核苷酸損傷和蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象的發(fā)生，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，維持活性氧在植物體內(nèi)的代謝平衡，減輕活性氧的對(duì)其的傷害［3－4］。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化重要的產(chǎn)物，其含量的變化能間接反應(yīng)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷和抗逆性。一般認(rèn)為植物在低溫脅迫下可溶性蛋白和可溶性糖含量會(huì)有所上升，以修復(fù)低溫對(duì)植物細(xì)胞所帶來的損傷［5－7］。

本實(shí)驗(yàn)以采于山西管涔山的殼假網(wǎng)衣（Porpidia crustulata）為材料，研究了其共生藻在不同培養(yǎng)溫度條件下，其SOD活力、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白的含量，以期了解地衣共生藻對(duì)溫度變化的響應(yīng)，為今后從地衣體中篩選抗逆性的藻株提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼假網(wǎng)衣（Porpidia crustulata），采自山西寧武管涔山。憑證標(biāo)本保存于山西大學(xué)植物標(biāo)本館（SXU）。共生藻經(jīng)分離純化后保存于本實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)鑒定為小球藻屬植物（Chlorellasp.GC）［8－9］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在250mL三角瓶中加入150mL已滅菌的BG11培養(yǎng)液（pH＝7.5），接種1mL藻液，Chlorellasp.GC的初始接種濃度分別為3.8×106個(gè)／mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)溫度梯度，分別為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃，在人工氣候箱（上海博訊，BSG－300）中培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行，光暗比12h∶12h，光照強(qiáng)度2000lx。

1.2.1 MDA 含量的測(cè)定

MDA含量采用南京建成生物工程公司MDA酶標(biāo)法試劑盒測(cè)定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時(shí)分別取5mL藻液，在高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL－16G－C，上海安亭）中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mLPBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細(xì)胞破碎儀（JY92－Ⅱ，寧波新芝）中進(jìn)行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入1000μL工作液，混勻。95℃水浴20min，取出后冷卻。在530nm處，用多功能酶標(biāo)儀（MD，SpectraMax－M5，美國(guó)）測(cè)吸光度。按照試劑盒說明書提供的計(jì)算公式計(jì)算。

1.2.2 SOD活力測(cè)定

SOD采用南京建成生物工程公司W(wǎng)ST－1法試劑盒測(cè)定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時(shí)分別取5mL藻液，在高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取20μL清液，加入20μL工作液，200μL底物應(yīng)用液。37℃恒溫培養(yǎng)箱（HPX－9052MBE，上海博訊）溫浴20min。在450nm處，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。按照試劑盒說明書提供的計(jì)算公式計(jì)算。

1.2.3 可溶性糖含量測(cè)定

采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量。吸取濃度為0、10、20、30、40、60、80μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1mL，加蒽酮試劑4mL，各管快速搖勻后立即放入沸水浴10min。取出后冷卻，以空白作對(duì)照，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其在620nm波長(zhǎng)下的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，可溶性糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時(shí)分別取5mL藻液在高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取200μL上清液，加入800μL蒽酮試劑沸水浴10min，取出后冷卻。在620nm處，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度。可溶性糖含量（%）＝（C×V總×D）／W×V測(cè)×106×100，式中：C由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的糖含量（μg），V總提取液總體積（mL），D稀釋倍數(shù)，W 樣品重量（g），V測(cè)吸取的提取液體積（mL）。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

可溶性蛋白含量使用南京建成生物工程公司蛋白定量測(cè)試試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）進(jìn)行測(cè)定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時(shí)分別取5mL藻液，在高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10 min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入3mL考馬斯亮藍(lán)應(yīng)用液，混勻，靜止10min后精確吸取250μL加入酶標(biāo)板。在595nm處，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。按照試劑盒說明書提供的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并用t－檢驗(yàn)方法對(duì)回歸方程進(jìn)行回歸顯著性檢驗(yàn)；P＜0.05時(shí)，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)共生藻MDA含量的影響

由圖1可知，共生藻在5℃、10℃和15℃的低溫培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3d后，MDA含量迅速上升，之后，MDA含量又呈下降趨勢(shì)。0到3d的培養(yǎng)過程中MDA含量的迅速上升表明在5℃、10℃和15℃的低溫培養(yǎng)條件下，共生小球藻的細(xì)胞膜系統(tǒng)受到了損傷。培養(yǎng)3d后共生藻逐步適應(yīng)了低溫的生長(zhǎng)環(huán)境，其MDA含量也回落。

Fig.1 Changes of MDA content of Chlorellasp.GC at different temperatures圖1 不同培養(yǎng)溫度下共生小球藻MDA含量變化

2.2 溫度對(duì)共生藻SOD活力的影響

在適宜的培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)受到外界環(huán)境影響時(shí)，其SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除活性氧自由基的能力。剛分離出的共生藻SOD活力遠(yuǎn)高于經(jīng)過培養(yǎng)后的（圖2），這可能與其長(zhǎng)期生活在寒冷的環(huán)境有關(guān)。培養(yǎng)3d后SOD活力整體呈下降趨勢(shì)，30℃培養(yǎng)條件下SOD活力最高，5℃到20℃培養(yǎng)條件下SOD活力逐漸升高，間接表明溫度的上升影響了共生藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)3d后SOD活力越來越低，這可能與其逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件和“地衣化”影響有關(guān)。為了更好地適應(yīng)共生關(guān)系，共生藻有著更強(qiáng)的活性氧自由基清除能力。

Fig.2 Changes of SOD activity of Chlorellasp.GC at different temperatures圖2 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻SOD活力變化

2.3 溫度對(duì)共生藻可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物細(xì)胞重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膠體和細(xì)胞液有重要的作用。一般認(rèn)為，植物細(xì)胞可溶性糖含量的高低與其抗寒性呈正相關(guān)［7］。由圖3可知，共生藻初始可溶性糖含量較高。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加和共生藻擺脫“地衣化”而自由生活，可溶性糖含量逐步升高。5℃和10℃培養(yǎng)條件下，可溶性糖含量高于其他培養(yǎng)溫度，表明共生藻在低溫條件下加強(qiáng)了水解作用，將淀粉、蛋白質(zhì)等大分子化合物大量降解成可溶性糖，增加細(xì)胞液濃度，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，提高機(jī)體抗寒能力［10－11］。由此可見，共生藻對(duì)低溫有較好的耐受性。為了更好地適應(yīng)共生生活，共生藻可能逐漸建立起了適應(yīng)寒冷氣候的適應(yīng)機(jī)制。

Fig.3 Changers of soluble sugar contents of Chlorellasp.GC at different temperatures圖3 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻可溶性糖含量變化

Fig.4 Changers of soluble protein contents of Chlorellasp.GC at different temperatures圖4 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻可溶性蛋白質(zhì)含量變化

2.4 溫度對(duì)共生藻可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量與其抗寒性密切相關(guān)，可溶性蛋白質(zhì)含量的增加有利于提高植物體的抗寒性。從圖4可以看出，共生藻初始可溶性蛋白質(zhì)含量較少，這可能與其被“地衣化”影響和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，可溶性蛋白質(zhì)含量經(jīng)歷了先升高再降低，再升高的過程。5℃和10℃培養(yǎng)條件下的可溶性蛋白質(zhì)含量較其它培養(yǎng)溫度下更高，表現(xiàn)出具有較好的抗冷性。這可能與其長(zhǎng)期生活在寒冷的氣候環(huán)境有關(guān)，在與地衣的共生中建立了適應(yīng)寒冷氣候的機(jī)制。

3 討論

據(jù)報(bào)道，低溫可降低植物細(xì)胞的代謝活力［12］，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)［13－16］，引起膜脂過氧化［17－19］，破壞活性氧代謝系統(tǒng)的平衡［20］，減弱呼吸作用，使細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量增加［21－22］。本研究采用多項(xiàng)指標(biāo)對(duì)殼假網(wǎng)衣共生藻對(duì)溫度變化的響應(yīng)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，在5℃和10℃的培養(yǎng)條件下，地衣共生藻MDA含量逐漸減少，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量逐步增加，與有關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果相一致。

Thüs等［23］指出，自由生活的藻細(xì)胞在逐漸演變?yōu)榈匾鹿采寮?xì)胞的過程中，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特性會(huì)受到“地衣化”的影響而發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)中殼假網(wǎng)衣共生藻在與真菌體的長(zhǎng)期互惠共生中，可能逐漸建立起了適應(yīng)管涔山地區(qū)寒冷氣候的機(jī)制，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗冷性。

由于地衣這一特殊的生物類群，生境要求嚴(yán)格，多數(shù)種類生長(zhǎng)相對(duì)較慢。因此，目前關(guān)于地衣共生藻生理生化特性方面的研究還很少。但正是由于其特殊性，有些地衣共生藻具有抗逆性較強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累較多等特性，這也提示我們今后應(yīng)重視和加強(qiáng)對(duì)這一類群的深入研究，為篩選優(yōu)良藻種提供更多的途徑。

［1］Honegger R.The Symbiotic Phenotype of Lichen－forming Ascomycetes［M］.Fungal associations Springer Berlin Heidelberg，2001：165－188.

［2］康俊梅.低溫脅迫下野牛草生理生化響應(yīng)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

［3］馮建燦，張玉潔，楊天柱.低溫脅迫對(duì)喜樹幼苗SOD活性、MDA和脯氨酸含量的影響［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2002，15（2）：197－202.

［4］Chris B，Marc V H，Dirk I.Superoxide Dismutase and Stress Tolerance［J］.Annu Rev Plant Pysiol Plant Mol Biol，1992，43：83.

［5］嚴(yán)寒靜，談鋒.桅子葉片生理特性與抗寒性的關(guān)系［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2005，14（4）：21－24.

［6］戴玉池，鄧霞玲，姜孝成，等.不同水稻品種幼苗期的耐寒生理鑒定及其利用［J］.湖南師范大學(xué)：自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（3）：86－89.

［7］王靜，楊持.冷篙抗寒生理特性的研究［J］.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，33（6）：673－676.

［8］Li B，F(xiàn)eng J，Xie S.Morphological and Phylogenetic Study of Algal Partners Associated with the Lichen－forming Fungus Porpidia Crustulata from the Guancen Mountains，northern China［J］.Symbiosis，2013，61（1）：37－46.

［9］Li B，F(xiàn)eng J，Xie S.Relationship Between the Algal Partners and the Growth of Lichen－forming Fungus Porpidia Crustulata［J］.Symbiosis，2014，62（2）：101－109.

［10］彭金光，孫玉宏，師瑞紅，等.10℃低溫對(duì)西瓜幼苗耐性生理指標(biāo)的影響［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12（10）：42－45.

［11］朱政，蔣家月，江昌俊，等.低溫脅迫對(duì)茶樹葉片SOD，可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38（1）：24－26.

［12］Anderson I C，Robertson D S.Role of Carotenoids in Protecting Chlorophyll from Photodestruction［J］.Plant Physiol，1960，35（4）：531.

［13］滕中華，周黨衛(wèi)，師生波，等.青藏高原三種高寒植物的質(zhì)膜透性變化與抗寒性的關(guān)系［J］.中國(guó)草地，2001，23（4）：37－47.

［14］嚴(yán)寒靜，談鋒.自然降溫過程中桅子葉片膜保護(hù)系統(tǒng)的變化與低溫半致死溫度的關(guān)系［J］.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，24（1）：91－95.

［15］王善廣，張華云，郭鄭，等.生物膜與果樹抗寒性［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，6（1）：37－40.

［16］楊亞軍，鄭雷英，王新超.低溫對(duì)茶樹葉片膜脂脂肪酸和蛋白質(zhì)的影響［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（1）：5－9.

［17］宋鳳鳴，葛秀春，鄭重.活性氧及膜脂過氧化與棉花對(duì)枯萎病抗性的關(guān)系［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2001，5（2）：110－116.

［18］路丙社，白志英，李會(huì)平，等.水分脅迫對(duì)阿月渾子幼苗葉片膜脂過氧化和膜磷脂脫酷化反應(yīng)的影響［J］.果樹學(xué)報(bào)，2004，21（1）：33－36.

［19］楊盛昌，謝潮添，張平，等.低溫脅迫下弓葵幼苗膜脂過氧化及保護(hù)酶活性的變化［J］.園藝學(xué)報(bào)，2003，30（1）：104－106.

［20］李瀚海，尹飛，王群.不同耐旱性玉米雜交種及其親本葉片活性氧代謝對(duì)水分脅迫的響應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（6）：1912－1918.

［21］武維華，張蜀秋，等.植物生理學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：188－189.

［22］郭惠紅.金邊衛(wèi)矛低溫抗性研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2004.

［23］Thüs H，Muggia L，Pérez－Ortega S，et al.Revisiting Photobiont Diversity in the Lichen Family Verrucariaceae（Ascomycota）［J］.Eur J Phycol，2011，46（4）：399－415.