梁敏慧，崔亞娟，何 梅，李 東，閆 紅

（1.北京工業(yè)大學(xué)，北京100124；2.北京市營養(yǎng)源研究所，北京100069）

葉黃素分析檢測方法的研究進(jìn)展

梁敏慧1，崔亞娟2，*，何 梅2，李 東2，閆 紅1

（1.北京工業(yè)大學(xué)，北京100124；2.北京市營養(yǎng)源研究所，北京100069）

葉黃素是一種無維生素A原活性的類胡蘿卜素，屬純天然色素，是天然的食品色素和食品強(qiáng)化劑。本文對近年來國內(nèi)外食品中葉黃素的定性定量檢測方法進(jìn)行了綜述，介紹了不同分析方法各自的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用，并分析了目前葉黃素分析方法存在的問題及發(fā)展趨勢，為今后的分析工作提供參考。

葉黃素，分析檢測，研究進(jìn)展

葉黃素（Lutein）屬于天然類胡蘿卜素，又名“植物黃體素”，在自然界中與玉米黃素共同存在［1］，萬壽菊是提取葉黃素的良好來源。Heinrich W ihelm Ferdinand Wackenroder從胡蘿卜根中首次提取得到了葉黃素。Handelman研究發(fā)現(xiàn)，人類視網(wǎng)膜中葉黃素濃度與視覺敏感度成正相關(guān)，研究人員確定了葉黃素是黃斑色素的化學(xué)組成成分之一。1995年美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)葉黃素作為食品補(bǔ)充劑，2007年我國衛(wèi)生部將葉黃素列入營養(yǎng)強(qiáng)化劑。葉黃素系統(tǒng)命名為3'3-二羥基-α-胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，分子量為568.85，結(jié)構(gòu)如下：

圖1 葉黃素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of lutein

葉黃素具有多種生理功能。可以減少藍(lán)光對視網(wǎng)膜的傷害，保護(hù)視力［2］；預(yù)防年齡性黃斑病變［3］；通過降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧類活性，對多種癌癥有預(yù)防和抑制作用，例如：乳腺癌［4］、胃癌［5］、結(jié)腸癌［6］等；葉黃素還具有抗動脈硬化［7］、抗氧化［8］等功效，經(jīng)常被作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到食品中，因此其定量分析對于控制產(chǎn)品質(zhì)量有非常重要的意義。近幾年，葉黃素的分析檢測技術(shù)已經(jīng)取得了重大的發(fā)展，特別是現(xiàn)代分析儀器與計(jì)算機(jī)技術(shù)的高度結(jié)合。根據(jù)現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)、報(bào)道，葉黃素的分析檢測方法主要有：紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、紅外光譜法、超臨界流體色譜法及核磁共振法等。在我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中，葉黃素的分析方法為液相色譜法［9-10］，方法比較單一。本文介紹了各種分析方法的原理、適用范圍以及各自特點(diǎn)，并分析了目前葉黃素分析方法存在的問題及發(fā)展趨勢，為葉黃素分析發(fā)展提供參考。

1 傳統(tǒng)的葉黃素分析檢測方法

紫外-可見分光光度法（Ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-vis）根據(jù)被測物質(zhì)濃度與吸光度成正比來進(jìn)行準(zhǔn)確分析，是一種簡單快速，低成本的檢測方法。葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵體系，受激發(fā)能產(chǎn)生可見紫外吸收光譜，因此，可利用紫外-可見分光光度法對葉黃素進(jìn)行定性定量分析。國際上通行的方法有AOAC法和FAO/WHO法，兩種方法如下［11-13］：

為了提高分光光度法的靈敏性及準(zhǔn)確性，許多研究人員對其進(jìn)行了改良。研究人員在改進(jìn)AOAC法時(shí)普遍采用的方法是用冷皂化代替熱皂化，并在皂化的過程中通入氮?dú)猓ㄟ^加入抗氧化劑降低葉黃素的分解，以氧化鎂和硅藻土代替硅膠作為層析吸附劑，調(diào)整洗脫劑正己烷∶乙腈∶甲醇的比例來提高葉黃素的分離效果。李高峰［14］在上述改進(jìn)方法基礎(chǔ)上，將洗脫劑正己烷∶乙腈∶甲醇的比例調(diào)整為70∶25∶5（體積比），最終使葉黃素的測定結(jié)果提高了33%。然而，無法分析葉黃素的不同異構(gòu)體、靈敏度差、易受干擾仍是紫外-可見分光光度法的突出缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約它的應(yīng)用和發(fā)展。

2 現(xiàn)代分析法

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）主要利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)細(xì)微的差異，從而達(dá)到分離、分析及測定的目的。HPLC法具有分離效果好、選擇靈敏性強(qiáng)、分離速度快、可與多種技術(shù)聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，是目前使用的最廣泛的對葉黃素進(jìn)行定量分析的檢測方法。

HPLC法用于葉黃素及其酯的定量分析，樣品處理過程是影響結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵步驟，目前葉黃素常用的提取方法包括：有機(jī)溶劑抽提法、微波提取法、超臨界CO2萃取法，其中有機(jī)溶劑抽提法是最常用的預(yù)處理方法。在分析過程中，多采用反相C18或反相C30色譜柱，此外正相硅膠柱也可用于類胡蘿卜素的分析檢測。儀器一般配備光二極管陣列檢測器（DAD或PAD）或紫外檢測器作為檢測系統(tǒng)，葉黃素檢測波長為（446±2）nm。Gill等［15］用HPLC建立了測定嬰兒奶粉中葉黃素的方法，以甲醇∶二氯甲烷（70∶30）作為流動相，反相C30柱洗脫，玉米黃質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，得到葉黃素回收率為101%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.2%，最低檢出限為1.4μg/100g。表明HPLC法是快速、準(zhǔn)確、可靠的定量嬰兒配方奶粉中葉黃素的方法。部分HPLC法定量測定葉黃素條件見表2。

表1 AOAC法和FAO/WHO法比較Table 1 The comparison of AOAC and FAO/WHO

表2 部分HPLC法定量測定葉黃素條件Table 2 Some HPLCmethods for quantification of lutein

HPLC法用于葉黃素的定性分析主要是分析其不同的異構(gòu)體形式。葉黃素具有多種同分異構(gòu)體，不同的構(gòu)象會造成生理學(xué)功能顯著的差異，因此對于樣品萃取物中異構(gòu)體形式的研究是十分重要的。分析類胡蘿卜素異構(gòu)體時(shí)，一般步驟為使用合適色譜柱將不同異構(gòu)分離，利用MS、NMR等方法確定異構(gòu)體類型，因此選擇合適的色譜柱，是將葉黃素單體和酯及其異構(gòu)體分離的關(guān)鍵，用于類胡蘿卜素分離的色譜柱主要有C18和C30柱兩種?；莶Φ龋?3-24］認(rèn)為在分離過程中，C30柱能分離類胡蘿卜素同分異構(gòu)體及順反異構(gòu)體，而C18柱則無法達(dá)到相同的分離效果，因此C30柱在分析測定類胡蘿卜素同分及順反異構(gòu)體時(shí)有著明顯的優(yōu)勢。李大婧等［25］通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了C18和C30色譜柱對葉黃素順反異構(gòu)體的分離效果，證實(shí)了在相同的洗脫條件下，C30柱比C18柱更適合用于分離葉黃素異構(gòu)體，并在此基礎(chǔ)上建立了高效液相色譜法測定葉黃素順、反異構(gòu)體含量的方法，采用高大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜對HPLC圖中的除反式葉黃素峰的其他主要峰進(jìn)行定性分析后，確定了順式結(jié)構(gòu)的種類，分別是：9-順式、9'-順式、13-順式、13'-順式葉黃素并且利用反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線對順、反異構(gòu)體進(jìn)行了定量分析，結(jié)果證明在40～200ng范圍內(nèi)峰面積和進(jìn)樣量線性良好，最低檢出限為0.8μg/L。Melendez等［26］對餐后人類血漿及白鼬肺組織中類胡蘿卜素同分異構(gòu)體進(jìn)行了研究，在62m in內(nèi)利用C30柱分離得到了48種人體內(nèi)主要類胡蘿卜素的同分異構(gòu)體，這是目前為止利用HPLC法分離得到最多種的類胡蘿卜素同分異構(gòu)體。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）將HPLC對樣品的高分離能力和MS的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，是食品分析和環(huán)境分析領(lǐng)域最受關(guān)注的方法之一。MS是對物質(zhì)進(jìn)行定性鑒定的有效方法，具有靈敏度高、進(jìn)樣量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前大氣壓電離（APCI-MS）、電噴霧電離（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDIMS）等質(zhì)譜方法都被用于葉黃素的分析檢測，其中APCI源應(yīng)用最廣泛。

LC-APCI-MS只產(chǎn)生單電荷峰，適用于非極性或低、中等極性且對熱穩(wěn)定的化合物。葉黃素作為一種非極性的類胡蘿卜素，因此APCI源相比于ESI源更適合作為葉黃素分析測試的離子源［27］。Tsao等［28］通過HPLC-APCI-MS聯(lián)用的方法，利用葉黃素順式異構(gòu)體在330nm附近的特征光譜吸收，成功從萬壽菊中分離鑒定了6種順式葉黃素二酯：順式葉黃素二豆蔻酸酯、順式豆蔻酸-棕櫚酸酯、順式二棕櫚酸酯、順式棕櫚酸-硬脂酸酯、順式月桂酸-棕櫚酸酯及順式肉豆蔻酸-硬脂酸酯。Mellado-Orteg等［29］則首次從谷物中分離鑒定出了4種3-O-和3'-O-位置的葉黃素二酯的異構(gòu)體。

LC-ESI-MS是一種靈敏度高、適用范圍廣的檢測方法，近幾年來也逐漸被用于對葉黃素進(jìn)行分析。程紅艷等［30］建立滸苔中葉黃素的高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜定性定量方法，在選定的最佳儀器條件下，葉黃素檢出限為0.03mg/L，峰面積的RSD為1.13%，保留時(shí)間RSD為0.38%；并確定了電噴霧質(zhì)譜分析葉黃素特征離子為m/z為589及306，在此基礎(chǔ)上推斷了葉黃素電噴霧質(zhì)譜可能的裂解方式，見圖2。

圖2 葉黃素電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律圖Fig.2 Pyrolysis of lutein

液-質(zhì)聯(lián)用方法的建立，提高了葉黃素及其異構(gòu)體的鑒定能力，同時(shí)降低了物質(zhì)的檢測限，十分適合天然來源葉黃素的分析，是未來葉黃素測定的發(fā)展趨勢。但是，該法基質(zhì)效應(yīng)較大，對樣品預(yù)處理及操作過程有較高的要求。

2.3 紅外光譜法

紅外光譜法（Infrared spectroscopy，IR）是根據(jù)物質(zhì)對紅外光區(qū)的電磁輻射的不同選擇性吸收來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及定性定量檢測的分析方法。通過對光譜進(jìn)行分析，可對物質(zhì)進(jìn)行定性鑒定，對特征吸收譜帶強(qiáng)度測量可對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。紅外光譜一般分為近紅外區(qū)（13330～4000cm-1）、中紅外區(qū)（4000～400cm-1）和遠(yuǎn)紅外區(qū)（400～10cm-1），其中中紅外區(qū)是應(yīng)用和研究最廣泛的區(qū)域，近紅外區(qū)以及近紅外光譜與其他分析技術(shù)聯(lián)用是最近研究人員的研究熱點(diǎn)［31］。

時(shí)有明等［32］通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)比較了萬壽菊花瓣和花渣的葉黃素紅外光譜，確定了羰基吸收峰對葉黃素酯單一的來源性，得出可以通過比較兩者光譜中羰基吸收峰的相對強(qiáng)度來定性反映花瓣中葉黃素酯的提取程度。利用此方法，可以為工業(yè)生產(chǎn)中監(jiān)控葉黃素酯生產(chǎn)過程提供一種更簡單靈敏的方法。

有機(jī)物的近紅外光譜吸收主要是由于X-H基團(tuán)的運(yùn)動所引起，葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有-OH鍵，能產(chǎn)生特定的吸收光譜，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)中的分析統(tǒng)計(jì)模型，可對其進(jìn)行定性定量分析。Chen等［33］首次使用近紅外光譜法（NIRS）定量測定了羽衣甘藍(lán)中的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量，通過采集151個(gè)樣本的近紅外光譜圖像數(shù)據(jù)并與高效液相色譜法精確測得的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量進(jìn)行比對，建立了偏最小二乘法近紅外光譜多元預(yù)測模型，其校準(zhǔn)方程的相關(guān)系數(shù)分別為0.983和0.982，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.065和0.131mg/g干重，結(jié)果說明通過近紅外光譜法對羽衣甘藍(lán)中類胡蘿卜素物質(zhì)的定量分析是可行的。鄒小波［34］利用近紅外高光譜圖像和HPLC法分析了黃瓜葉片中的色素含量，其中葉黃素的光譜與色素含量的預(yù)測模型的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.8262，得出結(jié)論：近紅外高光譜圖像技術(shù)可以快速分析黃瓜葉中的葉黃素含量。該方法不受樣品狀態(tài)的限制，特征性強(qiáng)，樣品處理過程簡單，十分適合大量相同樣品的質(zhì)控分析與監(jiān)測，但此法定量靈敏度較低，用于定量分析誤差較大，不適用于微量葉黃素的定量測定，而且由于食品成分的復(fù)雜性，建立一種或幾種預(yù)測模型并不能適用于所有的樣品測定，其實(shí)際應(yīng)用性有待提高。

2.4 超臨界流體色譜法

超 臨 界 流 體 色 譜 法（Supercritical fluid chromatography，SFC）是依靠超臨界流體的溶劑化能力對樣品進(jìn)行分離分析。在達(dá)到相同分離效率的條件下，SFC速度比LC快，可用于分離一些LC和GC難以分離和分析的物質(zhì)，尤其對于一些熱敏性、低揮發(fā)性的化合物具有良好的分離分析效果。Abrahamsson等［35］采用超臨界流體色譜法同時(shí)分離測定柵藻中包括葉黃素在內(nèi)的8種類胡蘿卜素，得到了葉黃素的檢出限和定量限分別為0.05mg/L和0.14mg/L。該方法分析迅速，所需試劑簡單，僅用到CO2和甲醇，安全性優(yōu)于需要多種用于分離的有機(jī)溶劑的HPLC法。

SFC法可與多種檢測器聯(lián)合使用，如：MS、FID、UV-vis、電子捕獲等檢測器，其中SFC與MS聯(lián)用將物質(zhì)分離測定結(jié)合在一起，成為分析測定類胡蘿卜素類物質(zhì)的非常有效的分析手段［36］。Matsubara等［37］首次利用SFC-MS法分析測定了葉黃素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、花黃質(zhì)、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)這7種類胡蘿卜素，以CO2和含0.1%甲酸銨的甲醇為流動相，超臨界條件為：進(jìn)出口壓力分別為18MPa和10MPa，溫度35℃，利用聚合ODS柱成功將7種類胡蘿卜素分離，其中葉黃素的檢出限可達(dá)到55pg，該法選擇性強(qiáng)靈敏度高，適合生物類的樣品分析，為SFC-MS技術(shù)廣泛用于葉黃素的分離檢測奠定了基礎(chǔ)。

從目前SFC對葉黃素異構(gòu)體研究和應(yīng)用來看，其仍處于起步階段，尚不能取代HPLC用于葉黃素分離測定，暫時(shí)只能作為一種色譜領(lǐng)域的補(bǔ)充手段。不過，隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的SFC的商品化，SFC法必將得到廣泛重視和應(yīng)用。

2.5 核磁共振法

核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）是通過測量電磁波與外磁場中原子核之間相互作用來研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性，主要用于研究化合物的分子結(jié)構(gòu)信息，如今應(yīng)用最廣泛的是1H-NMR和13C-NMR。NMR用于探索葉黃素同分異構(gòu)體十分有效，能直接反映其分子的結(jié)構(gòu)，圖譜十分直觀，并且無需被測物標(biāo)準(zhǔn)對照品、樣品預(yù)處理步驟簡單、不破壞樣品，具有其他一些分析方法不可比擬的優(yōu)勢。德國學(xué)者Dachtler［38］就采用LC-NMR對菠菜及視網(wǎng)膜中葉黃素和玉米黃素同分異構(gòu)體進(jìn)行了分析。表3列出近10年來利用NMR分離鑒定葉黃素類物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道。

表3 部分NMR法分析測定葉黃素文獻(xiàn)Table 3 Some NMRmethods for lutein analysis

利用NMR圖譜中的化學(xué)位移或耦合常數(shù)對葉黃素的不同異構(gòu)體進(jìn)行鑒定，利用共振峰面積或峰高可以對異構(gòu)體的含量進(jìn)行測定。對于食品中葉黃素同分異構(gòu)體的測定，NMR法無法單獨(dú)使用，必須連接LC以保證達(dá)到良好的色譜分離效果，且NMR儀器價(jià)格較高，費(fèi)用昂貴，長期以來只是作為結(jié)構(gòu)測定的主要工具，其對葉黃素及其異構(gòu)體進(jìn)行定量分析的方法尚未有詳細(xì)的報(bào)道。

3 方法比較

前文綜述的方法優(yōu)缺點(diǎn)和適用性不盡相同，在進(jìn)行分析檢驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)自己的工作需求來選擇合適的分析方法。表4對不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。

表4 不同方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 4 The advantages and disadvantages of differentmethods

4 結(jié)語

隨著新技術(shù)新儀器的開發(fā)與應(yīng)用，作為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)的葉黃素，在提取分離、分析開發(fā)方面已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展。由于食品組成復(fù)雜及葉黃素多種異構(gòu)體的存在，上述技術(shù)并不能完全達(dá)到定性定量所需的要求，對于葉黃素的分析，主要集中在提高同分異構(gòu)體的分離效能以及定量檢測的靈敏度。因此：a.高選擇性、微量樣品前處理技術(shù)；b.多維色譜分離技術(shù)與質(zhì)譜、核磁共振等聯(lián)用技術(shù)；c.建立應(yīng)用范圍更廣的檢測方法仍是葉黃素測定研究熱點(diǎn)。HPLC-MS聯(lián)用法作為最近幾年新興的分析方法，通過對特定碎片離子的檢測對分析物進(jìn)行定性定量，是一種分析檢測的理想工具，目前尚未成為一種常規(guī)的檢測方法，但由于其較低的定量檢出限以及良好的普及性，將為功能葉黃素的分析檢測開拓一條新的途徑。

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Research progress on analytical method of lutein

LIANG Min-hui1，CUIYa-juan2，*，HE Mei2，LIDong2，YAN Hong1
（1.Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Beijing Nutrition Resources Institute，Beijing 100069，China）

Lutein was one of carotenoids without vitamin A activity. It was a pure natural pigment. Lutein was anatural food pigment and nutrition agent. This paper provided an overview of analytical methods about lutein，which introduced the principles，traits and applicability of these methods. The problems at present and theemphasis of analysis of lutein were put forward to give a light of the further work.

lutein；detection；progress

TS207.3

A

1002-0306（2015）08-0390-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.073

2014－03－13

梁敏慧（1992-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)分析。

*通訊作者：崔亞娟（1979-），女，碩士研究生，副研究員，研究方向：食品營養(yǎng)分析。

北京市科委科技新星計(jì)劃項(xiàng)目（2011059）。