陳茜，汪建明，*，胡可眉

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津市可美國際貿(mào)易有限公司，天津300461）

納豆菌發(fā)酵大豆蛋白制備抑菌發(fā)酵液的工藝優(yōu)化

陳茜1，汪建明1，*，胡可眉2

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津市可美國際貿(mào)易有限公司，天津300461）

利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵大豆分離蛋白，制備含有抑菌物質(zhì)的發(fā)酵液，以大腸桿菌及金黃色葡萄球菌為指示菌，測定不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)組10對(duì)照得出最佳條件為裝液量100 mL，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37℃，接種量12%，pH7.0，制備得到的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌抑制效果均較佳，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達(dá)到18.5 mm，較空白增加12.5 mm。關(guān)鍵詞：納豆菌；液體發(fā)酵；抑菌性；工藝優(yōu)化

隨著致病菌抗藥性的提高，開發(fā)微生物天然防腐劑成為食品藥品防腐研究的熱點(diǎn)。目前食品工業(yè)中使用的防腐劑大多是化學(xué)防腐劑，雖效果顯著，但對(duì)人體有一定的毒副作用［1］。納豆菌是20世紀(jì)初期由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)并分離出來的枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種［2］，可以分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)，使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機(jī)酸、寡聚糖等多種物質(zhì)，極易被人體所吸收［3］。且納豆菌代謝能夠產(chǎn)生納豆激酶，酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的小分子多肽等代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌作用，對(duì)人體無毒害，可以用來制備天然生物防腐劑［4-5］。

以大豆分離蛋白作為底物制備發(fā)酵培養(yǎng)基，研究納豆菌在不同條件下制備發(fā)酵液的抑菌性，通過單因素試驗(yàn)初步確定工藝參數(shù)，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳發(fā)酵條件，為大規(guī)模生產(chǎn)納豆菌發(fā)酵抑菌液提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆分離蛋白：山東德州瑞康食品有限公司提供；納豆菌劑、大腸桿菌（Escherichia.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院提供。

恒溫振蕩器：金壇市新航儀器廠；AB204-N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHP-781電熱恒溫培養(yǎng)箱：河北省黃石市醫(yī)療機(jī)械廠；DGG-101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHJ系列潔凈工作臺(tái)：上海匯龍儀表電子有限責(zé)任公司；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1納豆菌擴(kuò)大培養(yǎng)

稱取蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，Nacl0.5%于150mL三角瓶，0.1 mol/L NaOH調(diào)pH為7.2～7.4，121℃蒸汽滅菌20 min，作為納豆菌種子培養(yǎng)基［6］。待冷卻至室溫后，加入納豆菌粉，37℃搖床培養(yǎng)24 h，直至培養(yǎng)基由澄清變渾濁。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

稱取大豆分離蛋白6%，無水葡萄糖0.4%，Nacl 0.1%，生長因子Tween-80 0.2%于250 mL三角瓶，調(diào)pH為7.2～7.4。

1.2.3發(fā)酵液抑菌活性的測定

采用雙層平板打孔法對(duì)發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行測定［7］，指示菌選取大腸桿菌（革蘭氏陰性）與金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性）。

1.2.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌性影響

根據(jù)1.2.2配制納豆菌發(fā)酵培養(yǎng)基于150mL/250mL三角瓶，加入6%納豆種子液（體積分?jǐn)?shù)），于35℃、200 r/min的搖床中分別發(fā)酵40、44、48、52、56h。發(fā)酵液5000r/min離心10 min，上清液通過0.25 μm濾膜除菌體，通過1.2.3雙層平板法測定發(fā)酵液抑菌性。

1.2.5裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌性影響

根據(jù)1.2.2配制納豆菌發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL容量瓶，加水溶解至100、125、150、175、200 mL，加入6%納豆種子液（體積分?jǐn)?shù)），于200 r/min的搖床中35℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，上清液通過0.25 μm濾膜除菌體，通過1.2.3雙層平板法分別測定發(fā)酵液抑菌性。

1.2.6溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌性影響

根據(jù)1.2.2配制納豆菌發(fā)酵培養(yǎng)基于150mL/250mL容量瓶，加入6%納豆種子液（體積分?jǐn)?shù)），置于200r/min的搖床中，分別在30、32、35、37、39℃發(fā)酵48h。發(fā)酵液5 000r/min離心10min，上清液通過0.25μm濾膜除菌體，通過1.2.3雙層平板法分別測定發(fā)酵液抑菌性。

1.2.7接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌性影響

根據(jù)1.2.2配制納豆菌發(fā)酵培養(yǎng)基于150mL/250mL容量瓶，分別加入納豆種子液0%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（v/v），置于200r/min的搖床中，35℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵液5000r/min離心10min，上清液通過0.25 μm濾膜除菌體，通過1.2.3雙層平板法分別測定發(fā)酵液抑菌性。

1.2.8pH對(duì)發(fā)酵液抑菌性影響

根據(jù)1.2.2配制納豆菌發(fā)酵培養(yǎng)基于150mL/250mL容量瓶，加入納豆種子液10%（體積分?jǐn)?shù)），0.1 mol/L Hcl溶液分別調(diào)pH為6.7、7、7.2、7.5、7.7，置于200r/min的搖床中，35℃發(fā)酵48h。發(fā)酵液5000r/min離心10min，上清液通過0.25 μm濾膜除菌體，通過1.2.3雙層平板法分別測定發(fā)酵液抑菌性。

1.2.9發(fā)酵條件優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)發(fā)酵時(shí)間、裝液量、發(fā)酵溫度、接種量、pH的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳條件臨界區(qū)間，設(shè)計(jì)5因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)［8］，選取金黃色葡萄球菌作為指示菌進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。因素水平表如表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of fermentation condition optimization orthogonal experiment

由方差分析結(jié)果確定各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，得到產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳的發(fā)酵工藝條件。在最佳發(fā)酵條件下制備發(fā)酵液，對(duì)其抑菌性進(jìn)行驗(yàn)證。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在48 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，發(fā)酵液的抑菌圈直徑變化趨勢緩慢，48 h時(shí)之后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑有明顯增加，在56 h分別達(dá)到18.75 mm和18.25 mm。這可能是由于隨著發(fā)酵時(shí)間加長，菌種達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，對(duì)大豆蛋白的利用率增加積累更多代謝產(chǎn)物。綜合生產(chǎn)成本等實(shí)際情況選取最佳發(fā)酵時(shí)間為56 h。

圖1　發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.1Effect of fermentation time on the inhibitory activity

圖2　裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.2Effect of liquid capacity on the inhibitory activity

2.2裝液量對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響

由圖2可知，抑菌圈直徑大小隨著裝液量的減少而減小。當(dāng)裝液量100 mL時(shí)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑分別為16.5 mm和18 mm。由于納豆菌為革蘭陽性好氧菌，對(duì)氧氣有一定需要，裝液量越小，培養(yǎng)基中溶氧系數(shù)高，有利于微生物發(fā)酵代謝合成抗菌物質(zhì)，因此裝液量100 mL為菌種最佳生長條件之一。

2.3發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響見圖3。

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.3Effect of fermentation temperature on the inhibitory activity

由圖3可知，培養(yǎng)基發(fā)酵溫度在30℃～37℃范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑逐漸增加，溫度在39℃時(shí)抑菌圈直徑下降明顯。溫度升高反應(yīng)速率加大，生長代謝加快，微生物代謝物產(chǎn)量提高，但溫度超過一定范圍時(shí)不適宜微生物生長，產(chǎn)生的酶發(fā)生變性或失活，化學(xué)反應(yīng)速率降低，代謝產(chǎn)物減少［9］。且納豆菌生長溫度耐受值是40℃至45℃，溫度過高超過菌種產(chǎn)生耐受性孢子，不利于發(fā)酵過程的完成。所以最佳發(fā)酵溫度為37℃。

2.4接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響

接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響見圖4。

圖4　接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.4Effect of inoculation quantity on the inhibitory activity

實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4可以看出，隨著接種量增加，發(fā)酵液抑菌圈直徑也逐漸加大，但接種量超過8%時(shí)發(fā)酵液抑菌性有降低趨勢。這可能是由于微生物生長分為延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段，在一定范圍內(nèi)接種量越大，菌種生長速率越大，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速度越快，但接種量過大時(shí)，一定量的培養(yǎng)基消耗過快，菌種生長競爭力加大，不利于代謝過程和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，菌種越早步入衰亡期。結(jié)合兩種指示菌的抑菌性變化趨勢，選取8%為最佳接種量。

2.5pH對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響

pH對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響見圖5。

圖5　pH對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響Fig.5Effect of pH on the inhibitory activity

由圖5可以看出，培養(yǎng)基起始pH變化對(duì)發(fā)酵液抑菌性的影響相對(duì)較小。微生物生長環(huán)境的pH是影響其生長代謝的條件之一，這是因?yàn)閜H影響細(xì)胞膜表明帶電基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌［9］。研究表明納豆菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的過程中分泌胞外酶，培養(yǎng)基pH在7.0左右對(duì)其產(chǎn)酶和分泌胞外酶的能力影響變化較小。

2.6發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用正交分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，方差分析表如表3。

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of fermentation optimization orthogonal experiment

表3　正交試驗(yàn)方差分析Table 3Variance analysis of fermentation optimization orthogonal experiment

由表2正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表可知，A3B1C3D3E3為最佳組合，即發(fā)酵時(shí)間56h、裝液量100mL、發(fā)酵溫度37℃、接種量12%、pH 7.2。由表3方差分析可以得出各因素影響作用大小為接種量＞裝液量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞pH，各因素?zé)o顯著影響。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

1號(hào)孔為空白組生理鹽水，2號(hào)孔為發(fā)酵液，3、4號(hào)孔為平行對(duì)照。此時(shí)大豆蛋白發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為16.5 mm，與空白對(duì)照相比增加了10.5 mm。然而與正交實(shí)驗(yàn)組10比較可以看出，在A1B1C3D3E2實(shí)驗(yàn)條件下，抑菌圈直徑為18.5 mm，比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑大2 mm，所以選取實(shí)驗(yàn)組10為最佳發(fā)酵條件，即發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量100 mL，接種12%菌液，pH7.0，37℃下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

圖6　金黃色葡萄球菌的抑菌圈Fig.6Inhibition zone of Staphlococcus aureus

3　結(jié)論

通過發(fā)酵時(shí)間、裝液量、發(fā)酵溫度、接種量和pH的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)納豆菌液體發(fā)酵大豆蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間48 h、裝液量100 mL、發(fā)酵溫度37℃、接種量12%、pH 7.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同條件下制備的發(fā)酵液對(duì)常見致病菌大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌作為指示菌，在正交試驗(yàn)結(jié)果最佳發(fā)酵條件下抑菌圈直徑18.5 mm。

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Process Condition Optimization of Bacillus natto Liquid Fermented Soybean Protein for Antibacterial Production

CHEN Xi1，WANG Jian-ming1，*，HU Ke-mei2
（1.Tianjin University of Science and Technology，College of Food Engineering and Biology Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Kemei International Trade Co.，Ltd.，Tianjin 300461，China）

Bacillus natto liquid fermented soybean protein was able to produce liquor with antibacterial material.Determine the antibacterial activity with E.coli and Staphylococcus aureus which are the common pathogenic bacterium in human body.Research the effect of different fermentation condition factors on antibacterial activity and design orthogonal experiment to optimize it.The comparison between confirmatory experiment and experiment NO.10 showed that the best fermentation condition was liquid content 100 mL，fermentation time 48 h，temperature 37℃，inoculation quantity 12%，pH 7.0.In this condition，the inhibition zone of the two indicator bacterium were 18.5 mm，increase 12.5 mm compare with blank group.

Bacillus natto；liquid fermentation；antibacterial activity；processing optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.033

2014-06-16

陳茜（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品工程。

汪建明（1972—），女（漢），教授（博士生導(dǎo)師），博士，研究方向：動(dòng)植物蛋白的生物功能及應(yīng)用。