許曉菁趙瓊王祥河

（1.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院，天津　300380；2.天津市工業(yè)微生物研究所，天津　300462）

高產(chǎn)二羥基丙酮重組菌株的構(gòu)建

許曉菁1，2趙瓊2王祥河2

（1.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院，天津300380；2.天津市工業(yè)微生物研究所，天津300462）

旨在構(gòu)建一株過量表達編碼膜系甘油脫氫酶的sldAB基因的重組菌株，以提高二羥基丙酮產(chǎn)量。以氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H的基因組DNA為模板，運用PCR方法擴增得到基因sldAB，并連接到pBBR1MCS-2質(zhì)粒上，構(gòu)建表達載體pBBR1MCS-2-sldAB。通過電轉(zhuǎn)化將載體pBBR1MCS-2-sldAB轉(zhuǎn)化進入氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H內(nèi)，得到重組菌株GOX205。結(jié)果顯示，重組菌株構(gòu)建成功，其甘油脫氫酶的酶活力較之于出發(fā)菌株提高了26%。在甘油初始濃度100 g/L的甘油發(fā)酵培養(yǎng)基中，較之于出發(fā)菌株，GOX205的生長狀況良好，發(fā)酵52 h時DHA濃度達到94.1 g/L，較之于出發(fā)菌株提高了19.7%，甘油殘量降低了15.1 g/L。

1，3-二羥基丙酮；重組菌株；甘油；過量表達

1，3-二羥基丙酮（DHA）是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，可作為農(nóng)藥合成中間體、精細(xì)化工原料和醫(yī)藥前體，用途廣泛。DHA的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，當(dāng)前的生產(chǎn)方法以化學(xué)合成法為主，但從技術(shù)的經(jīng)濟型和環(huán)境的友好性來看，微生物發(fā)酵法更具經(jīng)濟和社會效益。自從1898年Bertrand發(fā)現(xiàn)利用細(xì)菌可以將甘油轉(zhuǎn)化為DHA后，各國科研人員對微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)DHA進行了多方面的研究［1］。

氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）是一種嚴(yán)格好氧菌，經(jīng)常被用于氧化甘油生成二羥基丙酮［2-6］。許多科研人員通過優(yōu)化工藝參數(shù)［7］，培養(yǎng)基組成［8］、溶氧［9］、培養(yǎng)方式［10］、反應(yīng)器類型［11，12］等方式來達到提高DHA產(chǎn)量的目的。也有人針對高產(chǎn)菌株的選育開展研究，例如從自然界篩選高產(chǎn)菌株［13］或者通過激光誘變［14］獲得高產(chǎn)菌株，華東理工大學(xué)的魏東芝等［15］申請的專利中公布了一種用重組基因工程質(zhì)粒pET-gdh和pET-ndh轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而構(gòu)建得到DHA產(chǎn)量提高的工程菌的方法，Li等［16］通過在乙醇脫氫酶缺失菌株中過量表達甘油脫氫酶提高了G. oxydans的DHA產(chǎn)量。

在G. oxydans菌中存在兩條甘油氧化的途徑，一條是甘油直接氧化成DHA，由不依賴于NAD的膜系甘油脫氫酶催化，最佳pH為6.0，然后DHA被激酶磷酸化成為磷酸二羥丙酮；另一條途徑是甘油被激酶催化成為甘油-3-磷酸，最佳pH為8.5，然后被依賴于NAD的脫氫酶氧化成為磷酸二羥丙酮，磷酸二羥丙酮通過PPP途徑分解代謝［17］。甘油發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的過程便是利用了不依賴于NAD的膜系甘油脫氫酶（以下簡稱GDH）的催化作用。該酶以氧氣作為最終的電子受體，催化中心定位于周質(zhì)空間，所以底物運輸不必透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)［18］。已有研究表明，甘油脫氫酶GDH是二羥基丙酮合成過程中的關(guān)鍵酶，提高甘油脫氫酶的表達量將提高底物轉(zhuǎn)化的效率［19，20］。本研究通過PCR方法獲得編碼甘油脫氫酶的基因sldAB，構(gòu)建載體pBBR1MCS-2-sldAB，通過電轉(zhuǎn)化將載體pBBR1MCS-2-sldAB轉(zhuǎn)化進入宿主ATCC621H內(nèi)，旨在得到過量表達甘油脫氫酶的重組菌株GOX205，為用于工業(yè)生產(chǎn)的二羥基丙酮重組菌株的構(gòu)建進行有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本實驗所用的菌株為G. oxydans ATCC621H，購自ATCC，由本實驗室保藏。大腸桿菌DH5α由本實驗室保藏。質(zhì)粒pBBR1MCS-2由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，該質(zhì)粒具有卡那霉素抗性，可以在大腸桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌中進行轉(zhuǎn)化。

1.1.2 酶與化學(xué)試劑 基因片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、蛋白酶K、Pfu DNA聚合酶和dNTP均購自TaKaRa公司。

甘露醇、甘油、NaCl、MgSO4·7H2O、酵母抽提物、蛋白胨、化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)G. oxydans染色體中sldAB基因序列設(shè)計引物，上游引物命名為sldab-fw、下游引物命名為sldab-re，分別在上下游引物兩端添加Hin dⅢ、Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.1.4 培養(yǎng)基 甘露醇液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母抽提物5.0，蛋白胨3.0，甘露醇25.0。

甘露醇固體培養(yǎng)基：在上述甘露醇液體培養(yǎng)基中加入1.5%（w/v）瓊脂粉。

甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基：上述甘露醇固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μg/mL，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中。

LB-卡那霉素固體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.5）經(jīng)高溫滅菌并冷卻至室溫后加入卡那霉素至終濃度為50 μg/mL，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中。

電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：甘露醇80，酵母抽提物15，MgSO4·7H2O 2.5，甘油0.5，CaCl21.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：甘油10，酵母抽提物20，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油30-200，酵母抽提物5，CaCO37。

1.2 方法

1.2.1 sldAB基因的擴增 利用細(xì)菌染色體提取試劑盒，提取氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H的染色體DNA，以其為模板用高保真Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min 。PCR產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書要求進行純化回收。

1.2.2 質(zhì)粒pBBR1MCS-2-sldAB的構(gòu)建 將擴增得到的sldAB基因片段4 μL與pBBR1MCS-2質(zhì)粒4 μL分別加入限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ、Eco RⅠ各0.25 μL，10×酶緩沖液2 μL，用無菌水將總體積補充

到20 μL，放于37℃條件下消化1-2 h。用試劑盒對酶切產(chǎn)物分別進行純化回收。在20 μL連接體系中，加入2 μL 10×T4連接酶緩沖液，1 μL T4連接酶，sldAB基因片段3 μL，根據(jù)pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的電泳條帶亮度確定pBBR1MCS-2片段的加入量，加水至20 μL，在16℃條件下連接2-3 h后，通過酶切驗證得到pBBR1MCS-2-sldAB質(zhì)粒。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株GOX205 采用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pBBR1MCS-2-sldAB導(dǎo)入氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H中，通過卡那霉素抗性壓力進行篩選，具體操作為：（1）制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：將氧化葡萄糖酸桿菌ATCC621H接種于裝有50 mL電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，將搖瓶放于30℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)至培養(yǎng)液在600 nm的吸光度達到0.4；將細(xì)胞通過在4℃，6 000 r/min條件下離心4 min進行收獲，并在30 mL的滅菌過的10%（v/v）甘油中重懸，細(xì)胞用冷的10%（v/v）甘油洗3次，最后重懸于2 mL 10%（v/v）甘油中，即為電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；（2）取400 μL電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞用于電轉(zhuǎn)化，每管感受態(tài)細(xì)胞加入 1 μL pBBR1MCS-2-sldAB質(zhì)粒，用移液器輕輕吸打均勻，置于冰上；（3）將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的 1 mm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按鈕電擊，脈沖電壓2 000 v；（4）立即加800-1 000 μL甘露醇培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞；（5）將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中置于30℃搖床中培養(yǎng)3-5 h；（6）吸取100-200 μL的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上，30℃條件下培養(yǎng)3-5 d；（7）挑選轉(zhuǎn)化子：挑出在甘露醇-卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上生長的單菌落，提取質(zhì)粒后進行酶切實驗驗證，得到轉(zhuǎn)化子GOX205。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性實驗 用傳代的方法考察轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，將GOX205在不含卡那霉素的甘露醇斜面上進行連續(xù)傳代20代，并將第1、10、20代轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后用PstⅠ進行酶切驗證。與此同時，進行搖瓶發(fā)酵實驗，將1、10、20代的轉(zhuǎn)化子分別接種于500 mL搖瓶中，每個搖瓶中均裝有150 mL甘油初始濃度為30 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200 r/min搖床上進行發(fā)酵實驗，發(fā)酵16 h達到發(fā)酵終點。比較第1、10、20代轉(zhuǎn)化子的甘油到DHA的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

其中，m為質(zhì)量，90為DHA的分子量，92為甘油的分子量。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 生物量測定 利用分光光度計測定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度，以O(shè)D600表示。

1.2.5.2 甘油和DHA的測定 高效液相法，Agilent 1100 HPLC儀，流動相為乙腈∶水（90∶10），色譜柱為Lichrospher 5-NH2（4.6 mm×250 mm），甘油采用示差檢測器，柱溫35℃，DHA采用紫外檢測器，檢測波長：271 nm［21］。

1.2.5.3 相對酶活力測定 發(fā)酵進入穩(wěn)定期后分別取重組菌株GOX205和出發(fā)菌株的發(fā)酵液20 mL，8 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，將細(xì)胞洗滌兩次后用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋成在OD600處吸光度值相同的細(xì)胞懸浮液。在250 mL的三角瓶中加入1 mL的細(xì)胞懸液和30 mL 1 mol/L的甘油，30℃，200 r/min反應(yīng)1 h，檢測生成的DHA的量。將1 mL出發(fā)菌株的細(xì)胞懸液中GDH的酶活力設(shè)為1，根據(jù)DHA量計算1 mL重組菌株GOX205細(xì)胞懸液中GDH的相對酶活力。

2 結(jié)果

2.1 目的基因sldAB的獲得

利用PCR方法擴增目的基因sldAB，并將反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果（圖1）顯示，擴增得到的片段大小為3 000 bp左右，經(jīng)測序比對與目的基因sldAB的同源性為100%。

圖1 sldAB基因的擴增

2.2 質(zhì)粒pBBR1MCS-2-sldAB的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-sldAB分別用Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳上跑膠驗證。若質(zhì)粒構(gòu)建成功，則經(jīng)過Bam HⅠ后應(yīng)出現(xiàn)大小分別為2 181 bp和6 012 bp的條帶；用Eco RⅠ酶切，應(yīng)出現(xiàn)一條8 193 bp的條帶。結(jié)果（圖2）顯示，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pBBR1MCS-2-sldAB質(zhì)粒酶切圖譜

2.3 重組菌株的穩(wěn)定性

第1、10、20代轉(zhuǎn)化子在提取質(zhì)粒并用Bam HⅠ酶切后，結(jié)果（圖3）顯示，經(jīng)過20次傳代后，并未發(fā)生質(zhì)粒丟失或回復(fù)突變現(xiàn)象，說明該重組菌株遺傳性能穩(wěn)定。同時，對1、10、20代的轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵性能實驗，其16 h轉(zhuǎn)化率分別為88.6%、89.8%和88.4%。結(jié)果（圖4）表明，經(jīng)過20次傳代后，轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵性能無明顯變化。

圖3 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性的驗證

2.4 相對酶活力測定

將GOX205與出發(fā)菌株在相同的搖瓶培養(yǎng)條件下（甘油初始濃度100 g/L，30℃，200 r/min）發(fā)酵至40 h時，兩菌株均已進入穩(wěn)定期，分別取兩種發(fā)酵液制備相同濃度的細(xì)胞懸液，測定GDH的活力。結(jié)果（圖5）顯示，相同細(xì)胞濃度條件下，重組菌株GOX205的酶活力是出發(fā)菌株的1.26倍。說明通過sldAB基因的過量表達，GDH的表達量有了明顯的提高。

圖4 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性的驗證（發(fā)酵實驗）

圖5 重組菌株GOX205的相對酶活

2.5 發(fā)酵性能考察

在5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵實驗考察重組菌株GOX205的發(fā)酵性能。發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油初始濃度為100 g/L，發(fā)酵溫度30℃，通氣量為6 vvm，培養(yǎng)時間為52 h，跟蹤測定發(fā)酵過程中發(fā)酵液吸光度變化與甘油消耗及DHA生成情況。同時將出發(fā)菌株ATCC621H做平行對照。結(jié)果（圖6-圖8）表明，在100 g/L的甘油發(fā)酵液中，GOX205的生長狀況良好，DHA濃度達到94.1 g/L，較之于ATCC621H提高了19.7%，甘油殘量較之于ATCC621H降低了15.1 g/L。

3 討論

底物抑制和產(chǎn)物抑制被認(rèn)為是制約G. oxydans轉(zhuǎn)化甘油生成DHA的轉(zhuǎn)化效率的重要因素。高濃度的DHA會阻礙甘油的進一步氧化，這種抑制作用對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損害，以至于細(xì)胞的活力隨時間指數(shù)下降，其間GDH的活力也受到影響［22，23］。在本研究中，當(dāng)提高甘油初始濃度至150 g/L和200 g/L時，5 L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵時重組菌株GOX205的 DHA產(chǎn)量分別達到133 g/L和124 g/L，而出發(fā)菌株的DHA產(chǎn)量分別為96 g/L和90 g/L。這說明當(dāng)GDH的表達量增大時底物抑制作用會降低，細(xì)胞活性能夠得以保持，這與Gatgens等［20］的研究結(jié)論一致。同時Gatgens等［20］的研究表明，過量表達sldAB基因時采用強啟動子可以使得sldB基因的表達量顯著提高，并且采用強啟動子表達的菌株在甘油初始濃度提高時顯示出更高的底物抑制消除作用。

圖6 重組菌株GOX205與出發(fā)菌株生長性能比較

圖7 重組菌株GOX205與出發(fā)菌株甘油消耗性能比較

圖8 重組菌株GOX205與出發(fā)菌株DHA產(chǎn)量比較

在G. oxydans的細(xì)胞內(nèi)，大部分甘油被GDH氧化成為DHA，同時一小部分被膜系乙醇脫氫酶（ADH）氧化生成甘油醛，進而轉(zhuǎn)化為甘油酸［24］，Habe等［25］構(gòu)建了adhA基因敲除的突變菌株，在甘油初始濃度100 g/L的間歇發(fā)酵中，G. oxydans野生菌在2 d內(nèi)消耗完大部分甘油，DHA產(chǎn)量為54.3 g/L，而突變菌株在相同的時間內(nèi)產(chǎn)生DHA 74.8 g/L，當(dāng)甘油初始濃度進一步增加時，突變菌株的優(yōu)勢更加明顯。在本研究中，重組菌株的相對酶活力較之于出發(fā)菌株提高了26%，而Li等［16］的研究顯示，在ADH缺失的菌株中過量表達sldAB時，GDH的酶活力較之于出發(fā)菌株可提高58%。與之類似的是，Gatgens等［20］在葡萄糖酸-2-脫氫酶缺失菌株中過量表達sldAB時，DHA的產(chǎn)量也高于在野生型菌株中過量表達。這提示我們，微生物的基因彼此之間存在相互關(guān)聯(lián)，要獲得更高的DHA產(chǎn)量，除了在過量表達sldAB時引入強啟動子，還可以結(jié)合代謝工程手段尋找與DHA生成相關(guān)的多個基因進行一系列基因工程操作。

4 結(jié)論

本研究中，通過利用基因工程手段過量表達編碼DHA合成途徑關(guān)鍵酶——甘油脫氫酶的sldAB基因，構(gòu)建了重組菌株GOX205，該菌株具有穩(wěn)定的遺傳性能，其發(fā)酵甘油生產(chǎn)DHA的性能較出發(fā)菌株有明顯的提高。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction of a Recombinant Strain Producing High-yield Dihydroxyacetone

Xu Xiaojing1，2Zhao Qiong1Wang Xianghe1
（1. Industrial Microbe Research Institute of Tianjin，Tianjin300462；2. Tianjin Product Quality Inspection Technology Research Institute，Tianjin300380）

This work aims to construct a recombinant strain containing gene sldAB over-expressing membrane-bound glycerol dehydrogenase for raising the yield of dihydroxyacetone（DHA）. Firstly， using genomic DNA of Gluconobacter oxydans ATCC621H as a template， sldAB amplified by PCR was ligated to the plasmid pBBR1MCS-2 and the expression vector pBBR1MCS-2-sldAB was constructed；subsequently the plasmid pBBR1MCS-2-sldAB was transformed into the G. oxydans ATCC621H by electrotransfer， and the recombinant strain GOX205 was obtained. Results showed that the recombinant strain was constructed successfully， and the activity of glycerol dehydrogenase increased by 26% compared with the original strain. When initial concentration 100 g/L of glycerol as carbon source， the growth of GOX205 was significantly improved compared with the original strain， the final DHA concentration was 94.1 g/L and increased by 19.7%， and the residue of glycerol decreased 15.1 g/L. Therefore， this study provides a basis for further improving the biotransformation process of DHA production.

1， 3-dihydroxyacetone；recombinant strain；glycerol；over-expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.025

2014-12-09

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（天津市自然科學(xué)基金）重點項目（10JCZDJC16600）

許曉菁，女，博士，高級工程師，研究方向：工業(yè)微生物發(fā)酵及檢測方法開發(fā)；E-mail：xxjmiss@163.com