徐曼蔣健束長龍張杰，宋福平，

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱　150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所　植物病蟲害國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193）

Cry1Ab/Cry1Ah雜合蛋白構(gòu)建與功能研究

徐曼1蔣健2束長龍2張杰1，2宋福平1，2

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

Cry1A類殺蟲蛋白是目前應(yīng)用最為廣泛的殺蟲蛋白，目前已經(jīng)報(bào)道的Cry1A類殺蟲蛋白之間存在普遍的結(jié)構(gòu)域交換現(xiàn)象。針對(duì)鱗翅目害蟲具有高活性的Cry1Ab與Cry1Ah蛋白開展研究，構(gòu)建了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白AhAhAb并測(cè)定了殺蟲活性。結(jié)果顯示，Cry1Ab、Cry1Ah的結(jié)構(gòu)域交換引起蛋白殺蟲活性的顯著變化，與出發(fā)蛋白相比，雜合蛋白AhAhAb喪失了對(duì)棉鈴蟲殺蟲活性，降低了對(duì)玉米螟、小菜蛾殺蟲活性。利用生物信息學(xué)方法對(duì)Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I建模，并分析其與其他Cry1A蛋白結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)差異，分析表明Cry1Ah與Cry1Ab的結(jié)構(gòu)域I有相同的碳骨架和二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是表面電勢(shì)分布有較大差異。進(jìn)一步分析雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab、Cry1Ah之間殺蟲活性差異的原因?qū)M(jìn)一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進(jìn)化規(guī)律有重要意義。

Cry1Ah；結(jié)構(gòu)域I；殺蟲活性

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，在形成芽胞的同時(shí)能產(chǎn)生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），對(duì)多種害蟲有特異殺蟲活性［1，2］。目前，Bt不僅被開發(fā)成生物農(nóng)藥在害蟲防治中得到應(yīng)用，表達(dá)Bt Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物也已經(jīng)被廣泛種植，實(shí)現(xiàn)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。其中，Cry1A是一個(gè)對(duì)鱗翅目害蟲有高活性的殺蟲蛋白家族，目前已知的Cry1A類基 因 有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ae、cry1Af、cry1Ag、cry1Ah、cry1Ai及cry1Aj等10個(gè)模式種類，112個(gè)殺蟲基因，編碼130 kD左右的蛋白（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/ Bt/）。這些基因中cry1Ab、cry1Ac應(yīng)用最為廣泛，cry1Ah是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所克隆的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的殺蟲基因（專利號(hào)：ZL20041000-9918.9），其編碼的 Cry1Ah 蛋白對(duì)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、亞 洲 玉 米 螟（Ostrinia furnacalis）和水稻二化螟（Chilo suppressalis）等多種鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性，超過目前商業(yè)化的 cry1Ab、cry1Ac 等基因［3，4］，具有巨大的應(yīng)用前景，目前正在利用其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲植物研究［5-7］。

Cry1A類蛋白屬于典型的3個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白（3 Domain，3D）。結(jié)構(gòu)域I由7個(gè)α螺旋組成（其中6個(gè)兩性螺旋圍繞1個(gè)中心螺旋）；結(jié)構(gòu)域II，也稱作β“三棱鏡”，由3個(gè)β折疊片對(duì)稱折疊形成一個(gè)“希臘鑰匙”形狀的結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域III，是一種兩個(gè)反平行的β-折疊片包裹在一個(gè)類似 “果凍卷”中的結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域I與蛋白插入細(xì)胞膜以及形成穿孔有關(guān)，結(jié)構(gòu)域II和III都與受體識(shí)別及結(jié)合有關(guān)，決定殺蟲特異性。對(duì)目前已經(jīng)明確殺蟲活性蛋白的各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)聚類發(fā)現(xiàn)，部分殺蟲活性（特別是Cry1類蛋白）可以由結(jié)構(gòu)域III的重組獲得，Cry毒素結(jié)構(gòu)域交換是一種殺蟲特異性進(jìn)化的機(jī)制。

通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三個(gè)蛋白之間有共同的結(jié)構(gòu)域II（序列一致性大于97%）；Cry1Ab、Cry1Ac有共同的結(jié)構(gòu)域I（序列一致性為98%）；而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的結(jié)構(gòu)域III（序列一致性為100%）。Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III與Cry1Ac、Cry1Ah不同，但是在Cry1A家族中比較常見，與Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白結(jié)構(gòu)域III序列一致性大于97%；Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I比較獨(dú)特，不僅與Cry1Ab、Cry1Ac不同，與所有報(bào)道的Bt殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)域I差異都較大（序列一致性都小于72%）。本研究通過同源建模的方法比較Cry1Ab和Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I結(jié)構(gòu)、表面電荷分布特點(diǎn)；進(jìn)一步構(gòu)建Cry1Ab和Cry1Ah的雜合蛋白并測(cè)定殺蟲譜，分析結(jié)構(gòu)交換對(duì)Cry1Ab和Cry1Ah殺蟲活性的影響，旨在對(duì)進(jìn)一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進(jìn)化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 本研究所用到的菌株和質(zhì)粒，見表1。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基及生化試劑 LB培養(yǎng)基：1.0% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1.0% 氯化鈉，pH7.0。ZYP-5052培養(yǎng)基和50×5052誘導(dǎo)劑。Primer star高保真DNA聚合酶購自寶生物工程大連有限公司（TaKaRa/Japan），限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒、DNA回收試劑盒等購自Axygen公司（Axygen/USA）。

1.1.3 供試?yán)ハx 敏感種群小菜蛾由本實(shí)驗(yàn)室提供；棉鈴蟲、亞洲玉米螟分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲組和玉米害蟲組提供；甜菜夜蛾由武漢科諾公司提供。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)分析 首先將要分析蛋白氨基酸序列提交NCBI保守結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）進(jìn)行比對(duì)，獲取蛋白中對(duì)應(yīng)Endotoxin_N，Endotoxin_M，Endotoxin_C三個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并通過BLAST的方法比較殺蟲蛋白氨基酸序列間的一致性。進(jìn)一步利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)3個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)氨基酸序列進(jìn)行自動(dòng)建模，獲得的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步用PyMOL軟件包進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)與表面特性分析。

1.2.2 雜合蛋白構(gòu)建 采用無縫克隆的方法構(gòu)建Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白AhAhAb，雜合蛋白具備Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域II、Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III，引物Cry1AhF和AhAhAbR用于擴(kuò)增Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域II，引物AhAhAbF和Cry1AbR用于擴(kuò)增Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III，表達(dá)載體是pET21b。雜合蛋白載體構(gòu)建引物序列，見表2。

表2 雜合蛋白載體構(gòu)建引物序列

1.2.3 雜合蛋白表達(dá)與分析 方向正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta（DE3），進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)條件見參考文獻(xiàn)［8］。在20 mmol/L Tris·Cl（pH8.0）緩沖液中進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后可溶組分和不可溶組份分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，蛋白電泳樣品制備與SDS-PAGE分析方法參見文獻(xiàn)［9］。蛋白定量后進(jìn)行活性測(cè)定，棉鈴蟲、亞洲玉米螟、小菜蛾、甜菜夜蛾的生物測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［10-12］。此外，利用Image-J軟件包對(duì)照片中試蟲的身長進(jìn)行測(cè)定，比較發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 Cry1Ah與Cry1Ab、Cry1Ac序列比較

通過NCBI保守結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫（Conserved domain database，CDD）進(jìn) 行 比 對(duì) 分 析 發(fā) 現(xiàn)，Cry1Ah1蛋白的結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III分別位于第57-275位、第280-481位、第491-629位氨基酸。分別將Cry1Ah1全長蛋白、3個(gè)結(jié)構(gòu)域核心活性區(qū)及3個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域與Cry1Ab、Cry1Ac進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Cry1Ah1的Endotoxin_N結(jié)構(gòu)域與Cry1Ab、Cry1Ac不同，而Cry1Ab的Endotoxin_C與Cry1Ac、Cry1Ah差異較大，3個(gè)蛋白的Endotoxin_M一致性大于98%（表3）。

表3 Cry1Ah1與Cry1Ab13、Cry1Ac1序列比較/%

2.2 Cry1Ah與Cry1Ab結(jié)構(gòu)域I比較

由于Cry1Ah1與Cry1Ab13除結(jié)構(gòu)域I差異外，兩者結(jié)構(gòu)域III還存在較大差異，因此可以通過構(gòu)建Cry1Ah1與Cry1Ab13雜合蛋白來分析Cry1Ah1結(jié)構(gòu)域I對(duì)Cry1A殺蟲蛋白活性的影響。利用SWISS-MODEL自動(dòng)建模功能分別獲得了Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I以及3個(gè)結(jié)構(gòu)域核心活性區(qū)的結(jié)構(gòu)信息（圖1），通過分子疊合比對(duì)發(fā)現(xiàn)，盡管Cry1Ah1與Cry1Ab13序列存在較大差異（31%），但是兩者結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒有差異（圖1）。進(jìn)一步分析了結(jié)構(gòu)域I的表面結(jié)構(gòu)與表面靜電勢(shì)分布，結(jié)果顯示盡管兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒有差異，由于氨基酸序列以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不同，兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)表面以及電勢(shì)分布都有所不同（圖2）。

圖1 Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I碳骨架及二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

圖2 Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I表面結(jié)構(gòu)以及靜電勢(shì)分布比較

2.3 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構(gòu)建與表達(dá)

由于Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III的氨基酸序列一致性分別為69%、98%和42%，進(jìn)一步構(gòu)建了AhAhAb雜合蛋白。圖3顯示，雜合蛋白AhAhAb含有了源于Cry1Ah1的結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II，源于Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域III；進(jìn)一步將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 Rosetta（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果（圖4）顯示AhAhAb細(xì)胞不可溶組分明顯出現(xiàn)約76 kD的目標(biāo)蛋白條帶，而可溶組分中未檢測(cè)到目標(biāo)蛋白條帶。

圖4 雜合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.4 生物活性測(cè)定

對(duì)AhAhAb蛋白進(jìn)行了小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲、甜菜夜蛾的殺蟲活性測(cè)定，結(jié)果（圖5）顯示，雜合蛋白AhAhAb對(duì)棉鈴蟲在100 ppm時(shí)無發(fā)育抑制或致死活性；在高濃度（100 ppm）時(shí)對(duì)甜菜夜蛾有發(fā)育抑制活性，處理組存活的試蟲平均體長為對(duì)照組的79%；對(duì)小菜蛾活性較低，LC50為10.99 ppm，95% 置信區(qū)間為（4.57-23.38）；對(duì)玉米螟的活性較低，LC50為13.66 ppm，95% 置信區(qū)間為（8.51-27.40），并且主要活性表現(xiàn)為發(fā)育抑制，在蛋白濃度為10.00 ppm時(shí)，只有7%的試蟲有較好的發(fā)育。

圖5 AhAhAb蛋白對(duì)甜菜夜蛾發(fā)育抑制活性

3 討論

Bt不僅可以殺滅多種農(nóng)業(yè)害蟲，而且其殺蟲活性具有高度的特異性，對(duì)非靶標(biāo)生物安全無害。Bt這種高度特異的殺蟲活性主要由其編碼的Cry蛋白決定的，因此研究Cry蛋白殺蟲特異性及其進(jìn)化規(guī)律對(duì)Cry蛋白改良與應(yīng)用有重要意義。本研究針對(duì)鱗翅目害蟲高效的Cry1Ab13與Cry1Ah1開展研究，分析雜合蛋白的殺蟲譜，對(duì)理解Cry1A蛋白殺蟲特異性的進(jìn)化有重要意義。

為了研究Cry蛋白殺蟲機(jī)制，目前已有多個(gè)殺蟲蛋白（Cry1［13］、Cry2［14］、Cry3［15］、Cry4［16］以及Cry8［17］）的三維結(jié)構(gòu)通過X射線晶體衍射的方法被解析出來，它們的結(jié)構(gòu)非常相似，都有3個(gè)結(jié)構(gòu)域。本研究利用同源建模的方法分析Cry1Ab13與Cry1Ah1的結(jié)構(gòu)域I發(fā)現(xiàn)，兩者具有相同的碳骨架，但是蛋白表面結(jié)構(gòu)和電荷分布都有所不同，這可以為進(jìn)一步分析雜合蛋白活性變化的原因提供結(jié)構(gòu)信息依據(jù)。

對(duì)目前已經(jīng)明確殺蟲活性蛋白的各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)聚類發(fā)現(xiàn)，部分殺蟲活性多樣性（特別是 Cry類蛋白）可以由結(jié)構(gòu)域III的重組獲得，Cry毒素結(jié)構(gòu)域交換是一種新的殺蟲特異性進(jìn)化的機(jī)制。例如：Cry1Ca和Cry1Cb以及Cry1Ea和Cry1Eb等蛋白的結(jié)構(gòu)域I和II非常相似，而序列分析發(fā)現(xiàn)Cry1Ca和Cry1Ea的結(jié)構(gòu)域III有共同的起源，Cry1Cb和Cry1Eb結(jié)構(gòu)域III也由相同的序列變異而來，與Cry1Be的結(jié)構(gòu)域III極為相似。進(jìn)一步的人工雜合蛋白構(gòu)建的研究也支持這一結(jié)論，一些Cry1蛋白（如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ba和Cry1Ea）對(duì)甜菜夜蛾低或無活性，當(dāng)它們的結(jié)構(gòu)域III被Cry1Ca取代后，則變得具有活性［18］。此外，進(jìn)一步的研究認(rèn)為，結(jié)構(gòu)域I交換會(huì)引起殺蟲蛋白在靶標(biāo)害蟲中腸道細(xì)胞形成孔洞大小的不同，不會(huì)影響蛋白的殺蟲特異性［19］。本研究涉及的Cry1Ac、Cry1Ab與Cry1Ah蛋白之間也存在結(jié)構(gòu)域交換的情況（Cry1Ab、Cry1Ac有相似的結(jié)構(gòu)域I和II、不同的結(jié)構(gòu)域III；Cry1Ac、Cry1Ah有相似的結(jié)構(gòu)域II和III、不同的結(jié)構(gòu)域I），這些變化沒有影響蛋白對(duì)主要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲的殺蟲譜［20］。本研究構(gòu)建的雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab相比，有相似的結(jié)構(gòu)域II和III、不同的結(jié)構(gòu)域I，殺蟲活性測(cè)定結(jié)果顯示，雜合蛋白喪失了對(duì)棉鈴蟲的殺蟲活性，改變了對(duì)玉米螟活性類型。然而，Cry1Ac與Cry1Ah之間同樣有相似的結(jié)構(gòu)域II和III、不同的結(jié)構(gòu)域I，但是兩者在這3種試蟲的殺蟲譜上卻沒有差異，只是活性強(qiáng)度略有不同。這些數(shù)據(jù)顯示，3D Cry蛋白殺蟲特異性不僅可能與結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III有關(guān)，還有可能與包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的3個(gè)結(jié)構(gòu)域的組合有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示，盡管Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I碳骨架和二級(jí)結(jié)構(gòu)其他Cry1A蛋白一致，然而由于氨基酸序列的差異，結(jié)構(gòu)域I的表面基團(tuán)及電勢(shì)分布有較大差異［21］。3D Cry蛋白中3個(gè)結(jié)構(gòu)域兩兩之間都有接觸，包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的不同的結(jié)構(gòu)域組合都會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)表面微環(huán)境的變化，這些變化可能會(huì)對(duì)Cry蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響。進(jìn)一步分析雜合蛋白AhAhAb與Cry1Ab、Cry1Ah之間殺蟲活性變化的原因?qū)M(jìn)一步揭示Cry1A類蛋白殺蟲特異性進(jìn)化規(guī)律有重要意義。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)鱗翅目害蟲具有高活性的Cry1A類蛋白開展研究，構(gòu)建了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白AhAhAb并測(cè)定了殺蟲譜，結(jié)果顯示Cry1Ab，Cry1Ah的結(jié)構(gòu)域交換引起蛋白殺蟲譜的顯著變化。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Creation of Cry1Ab/Cry1Ah Hybrid Proteins and Its Functional Analysis

Xu Man1Jiang Jian2Shu Changlong2Zhang Jie1，2Song Fuping1，2
（1. Northeast Agricultural University，Harbin150030；2. State Key Laboratory of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

Cry1A is the most widely used insecticidal protein， and the domain swapping in the reported Cry1A family frequently occurs. In this paper， we investigated the Lepidoptera pests’ highly active protein Cry1Ab and Cry1Ah， and constructed the hybrid protein AhAhAb from Cry1Ab/Cry1Ah and bioassayed the activities. The results showed that the domain swapping of two proteins Cry1Ab and Cry1Ah resulted in the insecticidal activities significantly changed. Compared with the origin proteins， hybrid protein AhAhAb lost the insecticidal activity to Heliothis armigera， caused the insecticidal activity to Ostrinia nubilalis， Plutella xylostella reduced. We then modeled Cry1Ah domain I， and compared the structure and the surface properties with other Cry1A proteins by bioinformatics methods. The results indicated that domain I of Cry1Ah and Cry1Ab had identical carbon skeleton and secondary structure but varied surface and potential distribution. The further studies on the reasons of the activity’s difference between hybrid protein AhAhAb and Cry1Ab or Cry1Ah will give enlightenment for unclosing the evolution pattern of insecticidal specificity of Cry1A family proteins.

Cry1Ah；domain I；insecticidal activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.012

2015-03-06

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2014ZX0800912B，2014ZX08009003-001-004）

徐曼，女，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：dianxin5@126.com

宋福平，男，研究員，研究方向：蘇云金芽胞桿菌；E-mail：fpsong@ippcaas.cn