閆霞 吳劍榮 鄭志永 詹曉北

（江南大學生物工程學院　糖化學與生物技術教育部重點實驗室，無錫　214122）

大腸桿菌K 235能量代謝擾動影響聚唾液酸合成的研究

閆霞 吳劍榮 鄭志永 詹曉北

（江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，無錫214122）

通過不同裝液量、不同氧化還原狀態(tài)的碳源和添加NAD+的前體煙酸來調控大腸桿菌胞內的能荷、還原力水平，研究胞內核苷酸和聚唾液酸合成之間的關系。結果表明，聚唾液酸合成量越高，胞內UTP含量越低、UMP含量越高；同時，合成UTP、CTP消耗大量ATP使胞內能荷水平較低。與其他碳源的發(fā)酵相比，以山梨醇為碳源時，由于胞內NADH水平的提高使菌體合成的聚唾液酸量最高。添加煙酸可以提高胞內的NAD+水平，導致胞內的氧化水平提高，從而使胞內還原產物如聚唾液酸、琥珀酸、乳酸的產量降低甚至消失。

大腸桿菌；聚唾液酸；能荷；核苷酸；氧化還原勢

聚唾液酸（Polysialic acid，PSA）是以N-乙酰神經氨酸為單體，以 α-2，8 和/或 α-2，9 糖苷鍵連接的聚合度在 8-400 的聚陰離子型線性多糖［1-4］，通常存在于脊椎動物細胞的神經黏附分子（NCAM）末端和一些致病菌（如大腸桿菌K1株和奈瑟斯腦膜炎球菌）細胞表面。在脊椎動物體內，PSA參與細胞遷移、突觸形成等生物功能且與神經系統(tǒng)的可塑性有關。由于PSA具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此PSA可用作神經再生修復的組織工程支架材料［5］。另外，PSA在結構上具有較多羥基，從而具有高度親水性，再加上其非免疫原性，使得聚唾液酸化的藥物可以延長在血液循環(huán)中的半衰期，是目前發(fā)現(xiàn)可以替代聚乙二醇（PEG）的比較理想的蛋白類藥物緩釋材料［6］。

目前，生產PSA的唯一方法是通過微生物發(fā)酵，之后從發(fā)酵液中提取、純化來制備［7，8］，用于生產PSA的大腸桿菌（Escherichia coli）主要有K235和K1兩株［9，10］。從1999年起，本實驗室對利用E. coli K235生產PSA進行研究，通過誘變、培養(yǎng)基的優(yōu)化、培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使PSA的產量較出發(fā)菌株提高了5倍［9，11］。但總體而言，PSA的產量仍較低，且菌株的PSA產量不穩(wěn)定，難以滿足產業(yè)化的需求。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)E. coli K235發(fā)酵生產PSA受溶氧的嚴重影響［12］，而氧作為電子傳遞鏈（Electron transport chain，ETC）的最終電子受體直接影響微生物細胞內的能荷（Energy charge，EC）和氧化還原狀態(tài)。調節(jié)微生物細胞內能荷、還原力的方法有細胞改造和發(fā)酵工藝調節(jié)兩種方法。其中，細胞改造方法包括：（1）通過基因工程操作使與NAD+/H代謝有關的酶過量表達［13，14］；（2）將與NAD+/H競爭的代謝途徑刪除［15，16］；（3）引入其他生物的NAD+/H再生系統(tǒng)［17，18］。發(fā)酵工藝調節(jié)方法包括：補加（1）外源電子受體例如富馬酸［19］、乙醛［20］；（2）不同氧化還原狀態(tài)的碳源［21］，如山梨醇、葡萄糖、葡萄糖酸鈉；（3）NAD+的前體。本研究嘗試利用不同氧化還原狀態(tài)的碳源和NAD+合成的前體來調控菌體細胞內能荷、還原力水平，探索其與PSA合成之間的聯(lián)系，用于指導PSA的生產合成。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli CCTCC M208088），由江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室保藏。ATP、ADP、AMP、UMP、UTP、NAD+等購于Sigma-Aldrich公司，其他藥品由國藥試劑提供。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉5，胰蛋白胨10，牛肉膏3，瓊脂粉20，pH7.2-7.4。種子培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉5，胰蛋白胨10，牛肉膏3，pH7.2-7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：山梨醇40，硫酸銨4.94，磷酸氫二鉀（三水）26.2，胰蛋白胨1.5，硫酸鎂0.9，pH7.8（滅菌前）。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng) 將保存于4℃ 冰箱里的菌種，挑取一環(huán)到準備好的固體斜面培養(yǎng)基上，在37℃ 恒溫箱內恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.2 種子培養(yǎng) 將斜面培養(yǎng)活化后的種子接種兩環(huán)于250 mL 三角瓶中（內裝50 mL種子培養(yǎng)基）后，放置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為轉速250 r/min、溫度37℃，培養(yǎng)8-10 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將準備好的種子培養(yǎng)基按照4%的接種量接種于250 mL三角搖瓶（內裝35 mL發(fā)酵培養(yǎng)基）后，250 r/min、37℃培養(yǎng)60 h。

1.2.4 煙酸對PSA發(fā)酵的影響 準確稱取1 g煙酸溶于1 L蒸餾水中，配制成1 g/L的煙酸溶液，滅菌待用。向分裝滅菌的1.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中（35 mL/250 mL）分別加入上述1 g/L的煙酸溶液175 μL、350 μL、525 μL、700 μL，配制成含煙酸為5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，研究煙酸對PSA發(fā)酵的影響。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 生物量測定 將樣品稀釋至一定倍數后，測定600 nm下吸光值，然后對照 OD600吸光度-菌體干重的標準曲線計算生物量，OD600=1.0相當于 0.4 g/L 細菌干重。

1.2.5.2 PSA的測定 對PSA的測定采用間苯二酚法［12］。

1.2.5.3 碳源及有機酸含量的測定 發(fā)酵液離心后即得待測樣品，利用高效液相色譜（LC-2010A，島津）測定，色譜柱為Aminex HPX-87H（9 μm，300 mm×7.8 mm，Biorad）；流動相為5 mmol/L硫酸；流動相流速0.6 mL/min；示差檢測器；柱溫35℃；進樣量5 μL。

1.2.5.4 胞內核苷酸的測定 樣品的處理：取4 mL對數中期發(fā)酵液，經4℃，12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，得到菌體，將獲得的菌體懸浮于2 mL預冷的0.1 mol/L pH7.4的磷酸鉀緩沖液中，超聲波破碎（超聲1 s，間隔1 s，）10 min，之后經4℃，12 000 r/min 離心10 min，得到的上清于HPLC中進行測定。

色譜條件：色譜柱為InertSustain C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu）；流動相為20%乙腈與含20 mmol/L四丁基溴化銨的0.4 mol/L pH7.0磷酸鈉緩沖液以1∶1混合；流動相流速0.5 mL/min；紫外檢測器；檢測波長254 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。

2 結果

2.1 裝液量對PSA發(fā)酵的影響

2.1.1 裝液量對PSA合成和菌體生長的影響 由圖1可以看出，與裝液量35 mL的發(fā)酵結果相比，其它裝液量下菌體的PSA產量和生長狀況都較差，尤其在裝液量大時更為明顯。當裝液量為50 mL時PSA產量和生物量分別為1.08 g/L和3.02 g/L，而裝液量為35 mL時，PSA產量和生物量分別達1.51 g/L和4.07 g/L。山梨醇消耗與PSA產量、菌體生長趨勢相一致。如圖1所示，當裝液量為35 mL，菌體的山梨醇消耗量最大，為22.40 g/L。

圖1 不同裝液量下的發(fā)酵參數

2.1.2 裝液量對有機酸合成的影響 不同裝液量下有機酸的合成情況如圖2所示。在裝液量小的情況下，檸檬酸合成量較高；當裝液量為25 mL時，檸檬酸的合成量最高，為62.33 mmol/L。而當裝液量分別為35 mL、40 mL、45 mL、50 mL時，檸檬酸的合成量比較接近，為55 mmol/L左右。獲得PSA產量最高的裝液量（35 mL）下，乙酸的合成量也最低（1.82 mmol/L），遠低于其它裝液量下的乙酸合成量，表明該條件下供氧充足，消耗的山梨醇用于菌體生長和PSA合成。在各個裝液量下乳酸、琥珀酸的合成量較低或無法檢測到，而在所有的裝液量下沒有乙醇的合成（數據沒有給出）。

圖2 不同裝液量下的有機酸合成量

2.1.3 裝液量對胞內核苷酸的影響 根據上述結果可知，E. coli合成PSA受溶氧的影響，而氧作為ETC的最終電子受體與氧化磷酸化產生能量密切相關。在不同裝液量下胞內能荷與PSA合成的關系如圖3所示，隨著搖瓶裝液量的增大，胞內ATP含量緩慢下降，從25 mL裝液量的3.22 μM/g·cell下降到50 mL裝液量的2.65 μM/g·cell，而EC水平在裝液量為35 mL時最低（0.22），此時PSA的產量最高。

在E. coli合成PSA的過程中，ATP除了用于菌體生長外，還用于合成UTP、CTP、GTP等高能物質。其中UTP用于UDP-葡萄糖胺和CTP的生成，CTP用于活化PSA合成前體——N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac）和2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO），因此菌體細胞內UTP、CTP的含量也將影響PSA合成。裝液量對胞內UTP、UMP的影響如圖3所示，隨著裝液量的增加，胞內UTP的量先下降后上升，在裝液量為35 mL時菌體細胞內的UTP含量最低，為3.38 μM/g·cell。而菌體細胞內UMP的含量隨裝液量的增加先上升后下降，在裝液量為35 mL時UMP含量最高，為83.19 μM/g·cell。菌體合成PSA消耗的UTP轉化為UDP、UMP，從而使UMP的量明顯高于其他裝液量。

根據上述分析，菌體PSA合成和溶氧有緊密的聯(lián)系，而氧氣在代謝過程中作為電子受體接受通過ETC傳遞的質子并最終被氧化為水，伴隨氧氣的氧化同時釋放能量，同時攜帶電子的載體是NADH，其與胞內氧化還原水平密切相關，因此胞內能荷、還原力的變化存在一定的關聯(lián)性。故初步確定PSA的合成與能荷、還原力有密不可分的關系。

2.2 不同氧化還原狀態(tài)的碳源對PSA發(fā)酵的影響

2.2.1 碳源對PSA合成和菌體生長的影響 分別以40 g/L山梨醇、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸鈉為碳源發(fā)酵生產PSA，結果如圖4所示。發(fā)現(xiàn)E. coli K235可以利用不同的碳源進行菌體生長，利用葡萄糖酸鈉為唯一碳源時菌體干重（1.66 g/L）僅是對照組（4.07 g/L）的40.8%。與其他碳源相比，山梨醇是生產PSA最有效的碳源。在以葡萄糖、木糖、葡萄糖酸鈉為唯一碳源時，菌體的PSA產量極低，甚至無法合成PSA，而以山梨醇為唯一碳源時，PSA產量最高。此結果表明，菌體細胞的還原狀態(tài)較高時更有利于PSA的生成。

圖3 不同裝液量下的胞內能荷、UTP、UMP

圖4 不同碳源下的發(fā)酵參數

在消耗碳源方面，當以山梨醇、葡萄糖、木糖為碳源時，發(fā)酵結束時碳源的消耗量分別為22.40 g/L、18.88 g/L和17.35 g/L，消耗碳源量比較接近；而以葡萄糖酸鈉為碳源時，發(fā)酵結束后葡萄糖酸鈉的消耗量達到37.41 g/L，碳源基本全部耗盡，如圖4所示。利用不同碳源發(fā)酵生產PSA時，山梨醇、葡萄糖、木糖的消耗主要在發(fā)酵過程的前25 h，而葡萄糖酸鈉為碳源時，其碳源消耗速度非?？?，在發(fā)酵進行僅12 h時，葡萄糖酸鈉的消耗量將近30 g/L。在以葡萄糖酸鈉作為碳源時，葡萄糖酸鈉的消耗量雖然很高，但是菌體濃度和PSA產量都較低，且乙酸大量合成。

圖5 不同碳源下有機酸的合成量

2.2.2 碳源對有機酸合成的影響 在呼吸方式方面，當以山梨醇為碳源時，菌體主要進行有氧呼吸，無氧呼吸產物極少，發(fā)酵液中乙酸、乳酸的含量分別僅為1.82 mmol/L和0.26 mmol/L（圖5）。而當以葡萄糖、木糖、葡萄糖酸鈉為碳源時，無氧呼吸明顯加強，發(fā)酵液中存在大量被氧化的副產物如乙酸，無氧呼吸代謝產物量明顯高于以山梨醇為碳源的發(fā)酵液中無氧呼吸代謝產物量。以葡萄糖酸鈉和葡萄糖為碳源時，發(fā)酵液中乙酸的量分別高達287.93 mmol/L和86.57 mmol/L（圖5）。而乙酸的生成伴隨1分子ATP的生成，這樣胞內ATP水平有所提高，更有利于菌體的生長。另外，一般情況下，乙酸的大量生成是由糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的不平衡引起的。在以葡萄糖或葡萄糖酸鈉為唯一碳源的情況下，除了積累大量的乙酸外，還有較多的乳酸生成（積累的乳酸量分別為1.70 mmol/L和0.29 mmol/L），比以山梨醇或木糖為碳源的乳酸積累量要高。而乳酸的生成意味著從丙酮酸到乙酰-CoA這一步的代謝速率降低，從而使糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)之間的不平衡降低。

當以木糖為碳源時，發(fā)酵液中存在大量的丙酮酸，高達395.4 mmol/L，沒有乳酸的生成，而其他碳源下的發(fā)酵液中并無丙酮酸的積累，如圖5所示。木糖為碳源時發(fā)酵液中乙酸的積累相對于葡萄糖、葡萄糖酸鈉為碳源時低。由于木糖在代謝過程中主要經過糖酵解途徑生成丙酮酸，在丙酮酸節(jié)點只有小部分經乙酰-CoA轉化為乙酸。在E. coli的代謝過程中，由丙酮酸生成乙酰-CoA時伴隨甲酸的生成，而在4種不同氧化還原狀態(tài)的碳源下發(fā)酵液中都未檢測到有甲酸的積累，這可能是由于無氧呼吸形成的甲酸在甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase，F(xiàn)DHF）的催化下分解為二氧化碳和氫氣。同時4種碳源下檸檬酸的合成量較接近、琥珀酸的合成量較低（數據未給出）。

2.2.3 不同碳源對胞內核苷酸的影響 分別以山梨醇、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸鈉為碳源進行PSA發(fā)酵時，最終PSA合成量明顯不同，測定對數中期胞內的EC水平，結果如圖6所示。與對照（以40 g/L山梨醇為碳源的發(fā)酵）相比，以葡萄糖或葡萄糖酸鈉為碳源時，胞內的EC水平較高，分別為0.42和0.40，遠高于對照的0.22。通過以上分析可知，當以葡萄糖或葡萄糖酸鈉為碳源時，菌體在代謝過程中生成濃度較高的乙酸，而乙酸的生成也偶聯(lián)合成ATP，所以當葡萄糖或葡萄糖酸鈉作為碳源時，胞內的ATP、EC水平相對較高。當以木糖為碳源時，由于菌體生成大量的丙酮酸，積累的丙酮酸并未通過無氧或有氧呼吸的方式釋放能量，從而導致以木糖為碳源時，胞內的ATP水平較低，且EC水平最低（0.21）。以葡萄糖酸鈉為碳源時，雖然生成乙酸量和生成乙酸偶聯(lián)生成的ATP量要遠遠高于以葡萄糖為碳源的情況，但由于其生成PSA量要高于后者，且在PSA的合成中需要大量的能量，最終導致胞內ATP、EC水平低于以葡萄糖為碳源的發(fā)酵。

圖6 不同碳源對胞內核苷酸的影響

PSA的合成需要UTP的參與并生成UDP-葡萄糖胺，足量的UTP是合成PSA的基礎。在4種不同的碳源下，以葡萄糖為碳源時，胞內的UTP含量最高（5.85 μM/g.cell）。此時沒有PSA的合成，所以UTP可以在胞內積累，相應UMP的量在胞內減少，如圖6所示。同理，在以葡萄糖、木糖、葡萄糖酸鈉為碳源時，PSA產量越低，胞內UTP含量越高，UMP含量越低。當以山梨醇為碳源時，菌體進行有氧呼吸生成的ATP激活UTP合成代謝中的天冬酸氨基甲酰轉移酶，從而導致胞內的UTP含量相對較高，且合成PSA時消耗的UTP使胞內的UMP、UDP含量也有所提高，胞內的UMP量高達83.2 μM/g.cell。

2.3 添加NAD+的前體煙酸對PSA發(fā)酵的影響

2.3.1 煙酸對PSA合成和菌體生長的影響 向以山梨醇為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的NA，研究NA對PSA發(fā)酵的影響。當向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，PSA的產量會下降（圖7），而且生物量、消耗山梨醇量也會隨之下降。向培養(yǎng)基中加入不同濃度的NA后，PSA產量從對照（沒有添加NA）的1.51 g/L下降到0.5 g/L左右，生物量同樣出現(xiàn)明顯的下降趨勢。NA的添加使山梨醇的消耗量明顯下降，當添加NA的量為10 mg/L時，山梨醇消耗量僅為8.03 g/L，比對照的山梨醇消耗量下降了64.2%。加入NA后PSA產量和生物量的下降可能是由于山梨醇的消耗量大幅度降低、微生物細胞的分解代謝受阻所致。

2.3.2 NA對有機酸合成的影響 微生物細胞中存在大量輔因子，如ATP、ADP、AMP、NADH、NAD+、NADPH、NADP+、乙酰-CoA及其衍生物、維生素和微量元素等，這些輔因子是大量生化反應的基礎。作為輔因子NAD+/H參與許多生化反應，胞內NAD+/H的改變會影響細胞生長和代謝產物的合成，甚至導致代謝流發(fā)生改變。當向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，使還原性代謝產物（聚唾液酸、琥珀酸、乳酸）的產量降低甚至消失，如圖8所示。當加入的NA量為5 mg/L時，琥珀酸和乳酸的合成量從對照的0.14 mmol/L、0.26 mmol/L分別下降到0.02 mmol/L、0.03 mmol/L。當NA的添加量高于5 mg/L時，菌體就不再合成琥珀酸和乳酸。與琥珀酸、乳酸不同的是，當加入NA后，即使?jié)舛容^高，仍有不需要消耗NADH的乙酸正常合成。乙酸的合成使細胞減少對NADH的利用量，從而導致細胞氧化還原狀態(tài)的平衡。添加NA后，菌體合成的檸檬酸量稍有降低（數據未給出）。

圖7 煙酸對PSA發(fā)酵的影響

圖8 煙酸對有機酸合成的影響

2.3.3 NA對胞內核苷酸的影響 向山梨醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的NA，其中以不含NA的培養(yǎng)條件為對照，取對數中期的細胞，測定胞內的EC、還原力水平。由于E. coli可以NA作為合成NAD+的前體物質，與對照相比，當向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，胞內的NAD+水平提高，如圖9所示。還原力（NADH/NAD+）水平相對降低，此時菌體會減少對NADH的利用，從而導致琥珀酸、乳酸的合成量降低（合成琥珀酸、乳酸所需要的酶是依賴NADH的酶），如圖10所示。

在向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，菌體合成的乙酸量降低，而乙酸的生成偶聯(lián)ATP的再生，同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中較高濃度的NA導致胞內還原力水平降低后，抑制NADH通過ETC產生能量，故添加NA后菌體細胞內的ATP水平有所降低。如圖9所示，當加入的NA量為15 mg/L時，胞內的ATP水平僅為2.05 μM/g.cell，比對照的低34.2%。故添加NA后，ATP的不足導致PSA的合成量明顯降低，由于用于PSA合成的ATP量減少，胞內的EC水平要高于對照的0.22。

圖9 煙酸對胞內能荷的影響

圖10 煙酸對胞內NAD+量、菌體有機酸合成量的影響

在向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，PSA合成量降低，故合成PSA消耗的UTP量降低，菌體細胞內積累的UTP量增加，如圖11所示。當添加10 mg/L NA后，菌體細胞內的UTP量高達3.67 μM/g·cell，高于對照的3.38 μM/g·cell。與UTP的變化相反，當菌體由于添加NA使合成PSA的量降低時，菌體細胞內積累的UMP會降低，從對照的83.2 μM/g·cell下降到36.6 μM/g·cell。

圖11 煙酸對胞內UTP、UMP的影響

3 討論

本研究在利用不同氧化還原狀態(tài)的碳源發(fā)酵生產PSA時，最終PSA產量明顯不同，其中以山梨醇為碳源時PSA產量最高，這與山梨醇在代謝過程中產生較多的NADH使細胞處于較高的還原狀態(tài)有關。Hong等［23］在利用E. coli工程菌生產琥珀酸時，選用山梨醇和葡萄糖分別作為碳源，結果表明山梨醇作為碳源提高琥珀酸產量與其提高胞內還原力（消耗1 mol山梨醇可以形成3 mol NADH，而同樣消耗1 mol葡萄糖卻只能產生2 mol NADH）有密切的關系，因為從PEP向琥珀酸的轉化中需要2分子NADH，而在山梨醇的代謝過程中比葡萄糖可形成更多的NADH［24］。同樣在琥珀酸的生產中，Lin等［21］在利用山梨醇為碳源時的產量比以葡萄糖為碳源時的高81%，而琥珀酸產量的提高是在胞內可利用的NADH量增加時產生，同時胞內NADH的增加也導致乙醇（在生成乙醇時需要消耗2分子NADH）的產量提高了62%。最近，Liu等［25］在利用E. coli生產莽草酸時，由于山梨醇較高的還原性使莽草酸的產量是用葡萄糖為碳源時的3.7倍。本研究中以葡萄糖、葡萄糖酸鈉為碳源時胞內較高的ATP、EC水平與乙酸的生成有關，因為乙酸的生成偶聯(lián)ATP的合成；以木糖為碳源時，由于菌體生成大量的丙酮酸，積累的丙酮酸并未通過無氧或有氧呼吸的方式釋放能量，從而導致以木糖為碳源時，胞內的ATP、EC水平都較低。

微生物會自動調節(jié)胞內的NADH水平，而對NADH/NAD+的比沒有嚴格的要求［26，27］。向培養(yǎng)基中添加NA后，雖然胞內NAD+總量提高，但NADH水平基本維持平衡狀態(tài)，從而導致胞內還原力水平下降。由于PSA的合成需要在較高的還原環(huán)境下進行，所以向培養(yǎng)基中加入NA后，PSA產量會降低。Liu等［20］利用光滑球擬酵母發(fā)酵生產丙酮酸時，當向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加8 mg/L NA后，胞內的NAD+量從未添加NA的13.1 mg/g DCW提高到28.6 mg/g DCW，從而降低了胞內NADH/NAD+水平；由于在丙酮酸合成代謝中需要消耗NAD+，故導致葡萄糖的消耗速率和丙酮酸的產量分別增加了48.4%、29%。

微生物細胞內NADH/NAD+水平的改變會導致代謝產物組成的變化。Berrios-Rivera等［28］向E. coli內引入來自Candida boidinii的NADH再生途徑，該途徑中的甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）可以將甲酸轉化為二氧化碳，并伴隨NADH的生成，而存在于E. coli內的FDH在催化過程中沒有NADH的生成，故該異源代謝途徑的引入可以提高菌體細胞內的還原水平。在厭氧和好氧條件下，異源NADH再生途徑對代謝物的組成都產生顯著的影響，在厭氧條件下主要形成還原代謝產物乙醇，而在好氧條件下由于胞內NADH的增多使菌體在有氧環(huán)境中卻轉向厭氧代謝，主要表現(xiàn)在乙醇、乳酸、琥珀酸等厭氧代謝產物的大量合成中。本研究向E. coli的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA后，胞內的NAD+水平明顯提高，此時菌體就會降低對NADH的利用。由于琥珀酸合成需要消耗2分子的NADH，乳酸的合成需要消耗1分子的NADH，菌體為了達到胞內氧化還原的平衡，減少了向琥珀酸、乳酸的代謝流量，當NA的添加量大于5 mg/L，菌體甚至停止合成琥珀酸、乳酸。

4 結論

可以利用裝液量、不同氧化還原狀態(tài)的碳源、煙酸等來調控菌體細胞內的核苷酸變化。當裝液量為35 mL時，PSA產量達到最高值1.51 g/L，由于合成PSA消耗胞內大量的ATP，導致EC水平較低。較其他碳源而言，山梨醇高的還原性使其成為發(fā)酵生產PSA的最有效碳源。胞內NAD+、NADH量的改變會影響PSA合成。當胞內NAD+增多會使PSA合成量減少，反之胞內NADH增多會使PSA合成量增多。

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（責任編輯 李楠）

Influence of Perturbation of Energy M etabolism in Escherichia coli K 235 on Biosynthesis of Polysialic Acid

Yan Xia Wu Jianrong Zheng Zhiyong Zhan Xiaobei
（Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122）

Different medium volumes， carbon sources with varied redox states and adding nicotinic acid， and the precursor of NAD+were used to adjust the intracellular energy charge and reduction of Escherichia coli in order to investigate the relationships between biosynthesis of polysialic acid and intracellular nucleotides. The results showed that the higher the production of polysialic acid was， the lower UTP was， but higher UMP was. Meanwhile， energy charge level was lower because the synthesis of UTP and CTP consumed a lot of ATP. Using sorbitol as carbon source， more polysialic acid was produced than those of fermentation with glucose， xylose and sodium gluconate due to the increase of NADH. Addition of nicotinic acid to the fermentation medium elevated intracellular NAD+， which led to the raise of intracellular oxidative stress，sequentially the decrease of the reducing metabolites such as polysialic acid， succinate and lactate， and even the vanish of them.

Escherichia coli；polysialic acid；energy charge；nucleotides；redox potential

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.030

2014-12-19

國家“863”計劃項目（2012AA021505），江蘇省自然科學基金項目（BK2011158）

閆霞，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：13643544548@126.com

吳劍榮，男，副教授，碩士生導師，研究方向：工業(yè)微生物；E-mail：kinowu@jiangnan.edu.cn