黃健黃美容駱詩露朱杰華閔迅

（1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，遵義 563003；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科，遵義 563003）

肺炎鏈球菌SPD1587蛋白的表達純化及晶體生長研究

黃健1黃美容2駱詩露1朱杰華1閔迅1

（1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，遵義 563003；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科，遵義 563003）

SPD1587蛋白是肺炎鏈球菌D39菌株中的一種轉錄因子，其在鼻咽部定植和肺部感染過程中發(fā)揮著重要作用。生物信息學分析提示其具有與A群鏈球菌的轉錄因子Mga蛋白相似的結構，目前其三維結構尚未被解析。成功構建了SPD1587蛋白的全長表達載體PET28a-spd1587，利用大腸桿菌BL21（DE3）菌株進行原核表達，獲得了以可溶形式表達的目的蛋白。經(jīng)Ni-NTA柱親和層析及DEAE陰離子交換層析純化后，獲得了高純度的目的蛋白。采用懸滴氣相擴散法獲得了SPD1587蛋白晶體。

肺炎鏈球菌；SPD1587蛋白；原核表達；晶體生長

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是引起細菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病的一種常見致病菌。其在嬰幼兒及老年人中具有較高的發(fā)病率與死亡率，全世界每年約有160萬人死于與S.pn感染相關的疾?。?］。毒力因子在肺炎鏈球菌致病過程中扮演著較為重要的角色，針對不同的感染局部微環(huán)境，其可通過自身轉錄因子調(diào)控莢膜多糖、磷壁酸等重要毒力因子的表達，以利于其建立感染及適應宿主局部微環(huán)境［2］。因此，研究肺炎鏈球菌毒力基因的轉錄調(diào)控機制，對于了解肺炎鏈球菌逃避宿主防御、建立感染的分子機制有重要意義。

Mga蛋白是A群鏈球菌中一種重要的轉錄因子，可調(diào)節(jié)多種重要毒力基因的表達［3］。SPD1587蛋白是肺炎鏈球菌中的一種與Mga蛋白結構相似的轉錄因子。研究顯示，其在肺炎鏈球菌鼻咽部定植及肺部感染中發(fā)揮著重要作用［4］。但其調(diào)控毒力基因表達的具體分子機制目前還了解較少，為了能更深入研究SPD1587蛋白在肺炎鏈球菌轉錄調(diào)控過程中的生物學功能，本研究擬對SPD1587蛋白進行原核表達、純化及晶體生長，以期為下一步的蛋白晶體衍射、結構解析及功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 肺炎鏈球菌D39菌株、大腸桿菌DH5α菌株、BL21（DE3）菌株、PET28a質粒均為本室保存。

1.1.2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Primer star 高保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I，T4DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；His Bind Column（Ni-NTA）樹脂、DEAE陰離子交換柱購自美國GE公司；蛋白晶體篩選試劑盒Crystal Screen Kit I&II及PEG screen I&II購自美國Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 采用NCBI保守結構域在線分析軟件（Conserved Domain Search Service），分析SPD1587蛋白結構域以預測其可能的生物學功能。

1.2.2 SPD1587蛋白原核表達載體構建 以肺炎鏈球菌D39菌株基因組DNA為模板，以上游引物：5'-CGCGGATCCATGAGAGATTTATTATCT -3'（下劃線為BamH I酶切位點），下游引物：5'-CCGCTCGAGTTACTCATCTAATCGAAT -3'（下劃線為Xho I酶切位點）擴增spd1587基因。擴增產(chǎn)物和PET28a質粒經(jīng)BamH I，Xho I雙酶切后進行連接構建PET28a-spd1587重組表達質粒，轉化入大腸桿菌DH5α菌株，在含50 mg/L卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒后行雙酶切鑒定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 SPD1587蛋白表達及純化 將鑒定正確的PET28a-spd1587表達質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）表達菌中，接種于LB培養(yǎng)液（含50 mg/L卡那霉素）中，37℃培養(yǎng)至光密度A600=0.5-0.6時，加入0.2 mmol/L的IPTG，25℃誘導8 h，12 000×g離心10 min收集菌體，超聲破菌后SDS-PAGE鑒定蛋白表達形式。破菌液經(jīng)12 000×g離心10 min收集上清液，用His Bind Column（Ni-NTA）對蛋白進行親和層析純化，并進一步利用DEAE陰離子交換柱對蛋白進行純化，后行SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度，純化的蛋白經(jīng)脫鹽、超濾濃縮后分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SPD1587蛋白的晶體生長 以5 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含50 mmol/L NaCl，pH8.0）稀釋蛋白濃度為20 mg/mL，用Crystal screen Ⅰ和Ⅱ、PEGⅠ和Ⅱ試劑盒以懸滴氣相擴散法行晶體初篩，池液200 μL，將1 μL母液與1 μL SPD1587蛋白混合后加樣于硅化處理的玻片上，用凡士林封板，在20℃恒溫條件下進行晶體生長。

2 結果

2.1 生物信息學分析

保守結構域分析（圖1）顯示，該蛋白擁有與Mga蛋白結構相似的2個DNA結合的HTH結構域和1個具有轉錄調(diào)控功能的 PRD結構域。

圖1 SPD1587蛋白保守結構域分析

2.2 目的基因的擴增及表達載體構建

挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，提取重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定，能夠獲得1 483 bp大小的酶切產(chǎn)物（圖2），經(jīng)測序鑒定插入序列與GenBank中肺炎鏈球菌D39菌株的spd1587基因序列完全相同（圖3）。

2.3 SPD1587蛋白的表達及Ni-NTA純化

含PET28a-spd1587重組表達質粒的大腸桿菌BL21（DE3）表達菌，經(jīng)IPTG誘導后SPD1587重組蛋白主要以可溶形式表達，分子量約為59 kD，與預期結果相符，經(jīng)Ni-NTA親和純化后，獲得了純度較好的目的蛋白（圖4）。

圖2 PET28a-spd1587重組表達質粒雙酶切鑒定

圖3 PET28a-spd1587原核表達質粒測序圖

圖4 重組蛋白SPD1587的SDS-PAGE電泳圖

2.4 重組蛋白SPD1587的DEAE陰離子交換純化

以DEAE陰離子交換層析進一步對SPD1587蛋白進行純化，從層析圖譜上可見一個較大的洗脫峰（圖5-A），收集該洗脫峰處的蛋白行SDS-PAGE分析，SPD1587蛋白純度達到了預期要求（圖5-B），可用于后續(xù)晶體生長。

2.5 SPD1587蛋白晶體生長

SPD1587蛋白在20℃條件下生長后，在多種條件下培養(yǎng)出了大小不一、呈長棒狀、欠規(guī)則的方形晶體（圖6-A），挑取晶體行SDS-PAGE電泳，結果（圖6-B）顯示其分子量大小與SPD1587蛋白相符，提示生長的晶體為SPD1587蛋白結晶而成。

3 討論

肺炎鏈球菌通常定植于健康人群的鼻咽部但并不致病，當宿主免疫力低下時，其會侵入肺、血液等部位，引起肺炎、敗血癥等嚴重疾?。?］。從鼻咽部遷移侵襲到肺的過程中，肺炎鏈球菌會調(diào)節(jié)相應毒力基因的表達，可呈現(xiàn)出透明型和不透明型細菌形態(tài)間的轉換［6］。不透明菌株較透明菌株在定植、生物被膜形成及上皮細胞粘附等能力上顯著減弱，但抗吞噬能力更強，可利于建立系統(tǒng)感染［7］。近年來肺炎鏈球菌的毒力基因調(diào)控網(wǎng)絡的研究成為其致病分子機制領域的一個熱點。鑒定出毒力基因相關的調(diào)控網(wǎng)絡將有助于設計新的抗菌藥物靶點從而抑制毒力基因的表達。目前，仍然有許多重要毒力基因的調(diào)控機制尚不清楚。

Mga蛋白是A群鏈球菌中一種重要的轉錄因子，與細菌毒力基因的表達調(diào)控密切相關［8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，當Mga蛋白201位的組氨酸突變?yōu)榫彼岷?，會顯著增強細菌的毒力，這與此突變可顯著增加mga基因表達，從而上調(diào)其他54種毒力相關基因表達有關［9］。SPD1587蛋白具有與Mga蛋白相似的DNA結合HTH結構域和轉錄調(diào)控功能域，它在不同血清型肺炎鏈球菌間高度保守，提示其可能在調(diào)控毒力基因表達過程中發(fā)揮著重要作用。利用基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)SPD1587蛋白可抑制肺炎鏈球菌rlrA致病島中多種毒力基因的表達［10］，但目前rlrA致病島僅存在于較少血清型肺炎鏈球菌中［11］，提示在不同血清型肺炎鏈球菌中或不同生長環(huán)境下，SPD1587基因的調(diào)控網(wǎng)絡可能存在差異。

圖5 陰離子交換層析（A）及SPD1587蛋白SDS-PAGE電泳圖（B）

圖6 SPD1587蛋白晶體（A）及SDS-PAGE（B）

目前，SPD1587蛋白的三維結構尚未被解析，而蛋白結構解析對于弄清其轉錄調(diào)控過程中的DNA結合方式、調(diào)控功能具有重要意義。因此，為開展對SPD1587蛋白晶體結構解析的工作，本研究對其進行了原核表達、純化及晶體生長研究。采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，本研究獲得了以可溶形式表達的SPD1587蛋白。經(jīng)Ni柱親和純化以及DEAE純化后，得到了純度較高的目的蛋白用于晶體培養(yǎng)，并成功培養(yǎng)出來質量較好的蛋白晶體，為下一步的蛋白晶體優(yōu)化、X射線衍射及結構解析奠定了很好的工作基礎。

4 結論

成功在大腸桿菌中表達出可溶形式的SPD1587蛋白，經(jīng)Ni柱親和純化以及DEAE純化后，得到了純度較高的目的蛋白用于晶體生長，最終獲得了質量較好的蛋白晶體。

［1］ Isaacman DJ， McIntosh ED， Reinert RR. Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe：impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines［J］. Int J Infect Dis， 2010， 14（3）：e197-209.

［2］ Chan WT， Nieto C， Harikrishna JA， et al. Genetic regulation of the yefM-yoeB toxin-antitoxin locus of Streptococcus pneumoniae［J］. J Bacteriol， 2011， 193（18）：4612-4625.

［3］ Hondorp ER， Hou SC， Hause LL， et al. PTS phosphorylation of Mga modulates regulon expression and virulence in the group A streptococcus［J］. Mol Microbiol， 2013， 88（6）：1176-1193.

［4］ Solano-Collado V， Lurz R， Espinosa M， et al. The pneumococcal MgaSpn virulence transcriptional regulator generates multimeric complexes on linear double-stranded DNA［J］. Nucleic Acids Res，2013， 41（14）：6975-6991.

［5］ Simell B， Auranen K， K?yhty H， et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease［J］. Expert Rev Vaccines，2012， 11（7）：841-855.

［6］ Arai J， Hotomi M， Hollingshead SK， et al. Streptococcus pneumoniae isolates from middle ear fluid and nasopharynx of children with acute otitis media exhibit phase variation［J］. J Clin Microbiol， 2011， 49（4）：1646-1649.

［7］ Wren JT， Blevins LK， Pang B， et al. Influenza A virus alters pneumococcal nasal colonization and middle ear infection independently of phase variation［J］. Infect Immun， 2014， 82（11）：4802-4812.

［8］ Sanson M， Makthal N， Gavagan M， et al. Phosphorylation events in the multiple gene regulator of group A streptococcus（Mga）significantly influences global gene expression and virulence［J］. Infect Immun， 2015， pii：IAI. 03023-14.

［9］ Sanson M， O'Neill BE， Kachroo P， et al. A naturally occurring single amino acid replacement in multiple gene regulator of group A Streptococcus significantly increases virulence［J］. Am J Pathol，2015， 185（2）：462-471.

［10］ Hemsley C， Joyce E， Hava DL， et al. MgrA， an orthologue of Mga，Acts as a transcriptional repressor of the genes within the rlrA pathogenicity islet in Streptococcus pneumoniae［J］. J Bacteriol，2003， 185（22）：6640-6647.

［11］ Solano-Collado V， Espinosa M， Bravo A. Activator role of the pneumococcal Mga-like virulence transcriptional regulator［J］. J Bacteriol， 2012， 194（16）：4197-4207.

（責任編輯 李楠）

Expression，Purification，Crystallization of SPD1587 Protein from Streptococcus pneumoniae

Huang Jian1Huang Meirong2Luo Shilu1Zhu Jiehua1Min Xun1
（1. Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003；2. Department of Blood Transfusion，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003）

SPD1587 protein is a transcription factor of streptococcus pneumoniae D39 strains， which plays an important role in nasopharyngeal colonization and lung infection. It has a conserved domain that was similar to transcription factors Mga of group A streptococcus，but the protein three-dimensional structure is unclear. In this study， the protein expression vector of PET28a-spd1587 was successfully constructed and a soluble form of SPD1587 protein was acquired in Escherichia coli BL21（DE3）strain. High purity SPD1587 protein was obtained by Ni-NTA affinity chromatography and DEAE negative ion exchange chromatography. The crystal of SPD1587 protein was obtained by the vapor diffusion method.

Streptococcus pneumoniae；SPD1587 protein；prokaryotic expression；crystal grow

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.035

2015-03-26

國家自然科學基金項目（81460317），貴州省社會發(fā)展公關計劃（2012GZ83293）

黃健，男，碩士，研究方向：細菌致病分子機制研究；E-mail：81537648@qq.com

閔迅，男，博士，研究方向：細菌蛋白疫苗及結構研究；E-mail：zmchj2001@163.com