張亮花爾并王華明

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

粉紅黏帚霉糖化酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

張亮1，2花爾并1王華明2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

用黑曲霉（Aspergillusniger）G1為宿主菌表達(dá)粉紅黏帚霉（Gliocladiumroseum）糖化酶。運(yùn)用PCR技術(shù)從粉紅粘帚霉中擴(kuò)增得到一個(gè)疑似糖化酶基因序列（約1.8 kb），并將其連接到載體pGm上組建成重組質(zhì)粒pGm-3440。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到黑曲霉G1菌株中，經(jīng)amdS篩選及PCR驗(yàn)證獲得表達(dá)糖化酶的黑曲霉重組工程菌。重組菌的發(fā)酵結(jié)果顯示，糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表達(dá)，用國(guó)標(biāo)法（QB/T 1803-1993）測(cè)得重組糖化酶活性達(dá)292 U/mL。進(jìn)一步對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該重組酶最適溫度和pH分別為50℃和5.0，該酶的耐熱性較差，pH穩(wěn)定性較好。

糖化酶；粉紅黏帚霉；黑曲霉G1；分泌表達(dá)

糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶［Glucoamylase，系統(tǒng)命名為淀粉 α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1，4-Glucanglucohydrolase（EC.3.2.1.3）］，是一種具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1，4-葡萄糖苷鍵，而得到終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1，6-葡萄糖苷鍵或α-1，3-葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖［1-3］。糖化酶在工業(yè)上具有重要的用途，例如，低熱量啤酒的釀造，酒精工業(yè)中谷物的水解，淀粉糖工業(yè)中生產(chǎn)葡萄糖、高葡萄糖糖漿，農(nóng)用化學(xué)品及藥物合成等［4-6］。糖化酶來(lái)源廣泛，已報(bào)道的產(chǎn)糖化酶真菌有23個(gè)屬，35個(gè)種，細(xì)菌有3屬3種［7］。由于黑曲霉能幾乎100%水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，其產(chǎn)生的糖化酶轉(zhuǎn)苷酶活性較低［8］。因此，工業(yè)生產(chǎn)用的糖化酶主要來(lái)自于黑曲霉。近些年，科學(xué)家們對(duì)糖化酶的研究主要集中在新基因、固定化、耐熱機(jī)制、基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄及糖化酶的新應(yīng)用等方面［9-11］。

黑曲霉是一種酶系豐富、代謝產(chǎn)物復(fù)雜的絲狀真菌。黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)具有優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌在高表達(dá)外源蛋白時(shí)容易形成包涵體，缺少真核細(xì)胞的一些翻譯后的修飾，其表達(dá)產(chǎn)物往往不具有生物活性，且包涵體的分離純化也比較困難。釀酒酵母分泌蛋白的能力較弱，且往往會(huì)過(guò)度糖基化，表達(dá)真核生物蛋白通常沒(méi)有活性。黑曲霉具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，并具有與哺乳動(dòng)物相似的糖基化修飾系統(tǒng)，可以對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工與修飾［12，13］。另外，黑曲霉已被美國(guó)政府認(rèn)定為食品藥品的安全生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵工藝及下游分離純化技術(shù)已相當(dāng)成熟［14］。因此，黑曲霉作為一種重要生產(chǎn)菌株被廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。已報(bào)道的黑曲霉產(chǎn)品包括檸檬酸、葡糖酸、沒(méi)食子酸、蛋白酶及淀粉酶等。

粉紅黏帚霉（Gliocladiumroseum）異名粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea），是一種重寄生真菌（hyperparasites），能夠寄生于其它真菌而營(yíng)寄生生活。由于粉紅黏帚霉能有效地抑制病原真菌的繁殖，自20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)粉紅黏帚霉主要被用作植物病原菌的生防菌［15-17］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)粉紅黏帚霉的研究主要在其寄生機(jī)理以及植物病害的防治效果上，對(duì)其基因的克隆研究較少，尚未見(jiàn)有粉紅黏帚霉糖化酶基因的研究報(bào)道。本研究首次將來(lái)源于粉紅黏帚霉的糖化酶基因在黑曲霉G1中進(jìn)行重組表達(dá)，并以酶活性高低和酶學(xué)性質(zhì)為指標(biāo)，旨在獲得一種酶活性高、耐熱性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低、有重要應(yīng)用價(jià)值的新型糖化酶。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；粉紅黏帚霉、黑曲霉G1為本實(shí)驗(yàn)室保藏。本研究所采用的黑曲霉G1宿主菌為糖化酶glaA基因和蛋白酶pepA基因雙敲除的菌株。

穿梭載體pGm圖譜如圖1所示，共計(jì)8 982 bp，其上有來(lái)源于黑曲霉的糖化酶強(qiáng)啟動(dòng)子PglaA，來(lái)源于塔賓曲霉的終止子TglaA，并含有氨芐青霉素和乙酰胺選擇性標(biāo)記，3個(gè)常用的酶切位點(diǎn)Xba I、Pac I和Xho I。

圖1 穿梭載體pGm圖譜

酶和試劑：PhusionDNA聚合酶購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，Xba I、Xho I限制性內(nèi)切酶、Gel Extraction Kit、Plasmid Kit、T4連接酶購(gòu)自Fermentas公司，F(xiàn)ungal DNA Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA公司，預(yù)制蛋白膠購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，酵母膏、蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司，裂解酶、乙酰胺、氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基與溶液LB、CMA、amdS篩選培養(yǎng)基［18］、MMSA、CSL、PromosoySpecial Medium 發(fā)酵培養(yǎng)基、Solution A、Solution B、Solution C、裂解液、微量元素。

粉紅黏帚霉全基因組測(cè)序工作由編號(hào)為11ZCZDSY08300的天津市工業(yè)微生物基因組解析項(xiàng)目完成，序列暫未公開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)所用的啟動(dòng)子為黑曲霉糖化酶強(qiáng)啟動(dòng)子，誘導(dǎo)物為麥芽糖，該麥芽糖存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 糖化酶基因在粉紅黏帚霉全基因組中的挖掘 用序列比對(duì)的方法將黑曲霉糖化酶（GenBank編號(hào)XP_001390530.1）序列與粉紅黏帚霉全基因組預(yù)測(cè)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，獲取相似性較高的序列。將相似性較高的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并用SignaIP分析信號(hào)肽，最終確定要克隆的糖化酶基因g3440。

1.2.2 糖化酶基因g3440的克隆 以粉紅黏帚霉全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因，PCR過(guò)程所用到的引物分別為：上游引物5'-CCGCTCGAGAGGATGGTGAAGATAATTC CCACTGTGC-3'，下游引物5'-TGCTCTAGATCATCG CCAGTTATCATTAGTCGAG-3'，下劃線處表示Xho I、Xba I兩限制酶酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：5×Phusion HF Buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，上下游引物（100 μmol/L）各0.4 μL，基因組1 μL，PhusionDNA polymerase 0.2 μL，Milli-Q H2O 13.6 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物及pGm載體用Xho I、Xba I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)Amp抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定正確后，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pGm-3440。

1.2.4 黑曲霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及篩選 將黑曲霉G1孢子在CMA液體培養(yǎng)基中30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌濾布收集菌體并用Solution A沖洗，轉(zhuǎn)移菌體至40 mL裂解液（40 mL Solution A中加0.6 g裂解酶）中，30℃、200 r/min裂解2-3 h。過(guò)濾并用兩個(gè)無(wú)菌50 mL離心管收集原生質(zhì)體，每管加Solution B至25 mL，4 000 r/min、5 min，棄上清；每管加 25 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，棄上清；合并兩管，加20 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，棄上清。加10 μL DNA、12.5 μL Solution C、100 μL原聲質(zhì)體，冰浴20 min。取出，加1 mL Solution C、2 mL Solution B，9 mL MMSA上層培養(yǎng)基，混勻倒入平板MMSA中，培養(yǎng)7-10 d直至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。用amdS篩選培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因組提取并進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序鑒定，鑒定正確的菌株即為重組黑曲霉菌株。

1.2.5 重組菌的發(fā)酵驗(yàn)證 挑取重組黑曲霉菌株，接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)5 d，14 000 r/min離心10 min收集上清液。取30 μL上清液，加10 μL 4×Loading Buffer，沸水煮5 min，用10%預(yù)制膠上樣10 μL進(jìn)行電泳，電泳條件200 V、45 min。

1.2.6 重組酶活性測(cè)定 重組糖化酶酶活測(cè)定按國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T1803-1993進(jìn)行。酶活定義：1 mL液體酶，于40℃、pH值為4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以（U/mL）表示。

1.2.7 生淀粉糖化酶活性測(cè)定 預(yù)先將酶液用乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH6.0）稀釋100倍，取3 mL加入250 mL三角瓶中，加入0.9 g玉米淀粉，再加入緩沖液24 mL，60℃、100 r/min培養(yǎng)1 h，并設(shè)未加酶液作為空白對(duì)照。取出加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，4 000 r/min離心10 min，取上清，用GOPOD試劑盒檢測(cè)還原糖的含量。

1.2.8 重組酶最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 用DNS法在pH4.6條件下測(cè)定不同溫度下重組酶的活力，以最高酶活100%計(jì)。在不同溫度下將重組酶保溫一段時(shí)間（5、10、15、30、60 和90 min），在最適條件下測(cè)定剩余酶活，以未處理的酶液酶活為100%計(jì)。1.2.9 重組酶最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定 在最適溫度下測(cè)定不同pH值下重組酶的活力，以最高酶活100%計(jì)。在室溫下將重組酶在不同pH值緩沖溶液中放置一段時(shí)間（1、2、4、8、20和32 h），在最適條件下檢測(cè)剩余酶活力，以未處理的酶液酶活為100%計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 糖化酶基因的挖掘

用序列比對(duì)的方法從粉紅黏帚霉全基因組中獲得了一個(gè)可能編碼糖化酶的基因g3440，其注釋信息為E5AAM7_Glucoamylase。該基因編碼一個(gè)含有527個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其序列已在2013年申請(qǐng)的專利（申請(qǐng)?zhí)?01310718737.2）中公開(kāi)。用VectorNTI軟件預(yù)測(cè)其分子量為56.4 kD。該蛋白序列與黑曲霉糖化酶相似性達(dá)48%，覆蓋度達(dá)97%（圖2）。用SignaIP分析發(fā)現(xiàn)該序列存在一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，推斷的信號(hào)肽切割位點(diǎn)在S22-E23之間，該信號(hào)肽屬于真核生物信號(hào)肽。

圖2 粉紅黏帚霉g3440基因的氨基酸序列與黑曲霉糖化酶序列同源性比對(duì)分析

該基因大小為1 825 bp，其cDNA大小為1 584bp，含有3個(gè)內(nèi)含子序列，大小分別為173、13和55 bp。將g3440基因的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與NCBI中已公布的來(lái)源于Leptosphaeriamaculans JN3 的糖化酶（GenBank編號(hào)XP_003844197.1）相似性最高（62%），因此，可判斷本研究擴(kuò)增到的是一個(gè)新糖化酶基因。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

通過(guò)對(duì)粉紅黏帚霉菌全基因組基因進(jìn)行PCR，獲得了大小正確的（1 825 bp）核苷酸序列（圖3）。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

2.3 轉(zhuǎn)化子基因組PCR鑒定

提取黑曲霉轉(zhuǎn)化子（5個(gè)）的基因組，PCR驗(yàn)證及電泳分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 轉(zhuǎn)化子菌株基因組PCR鑒定

2.4 重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶鑒定

SDS-PAGE（圖5）顯示1、4、5號(hào)轉(zhuǎn)化子均有表達(dá)。目的基因隨機(jī)重組到黑曲霉G1基因組中，2、3號(hào)菌可能是目的基因隨機(jī)重組的位點(diǎn)不正確，未能轉(zhuǎn)錄與翻譯。目的蛋白的分子量稍微偏大，用NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列中有2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，因此推斷該蛋白可能進(jìn)行了糖基化修飾，造成其實(shí)際分子量比根據(jù)氨基酸預(yù)測(cè)值大［19］。

圖5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的SDS-PAGE分析

2.5 重組酶的活性及酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 重組酶活性測(cè)定 用國(guó)標(biāo)法（QB/T 1803-1993）對(duì)重組酶液進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果顯示1號(hào)轉(zhuǎn)化子酶活性高達(dá)292 U/mL，4、5號(hào)轉(zhuǎn)化子酶活性分別為257 U/mL和263 U/mL。

2.5.2 生淀粉糖化酶活性測(cè)定 重組酶生淀粉糖化酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。反應(yīng)前后葡萄糖的變化可知1、4、5號(hào)轉(zhuǎn)化子生淀粉糖化酶活性均較低，甚至比出發(fā)菌株G1還低，因此認(rèn)為沒(méi)有生淀粉糖化酶活性。

表1 葡萄糖的含量

2.5.3 重組酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 用DNS法，在不同溫度下測(cè)定重組酶的活性。結(jié)果（圖6）顯示該酶的最適溫度為50℃。將重組酶在不同溫度下保溫并進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果（圖7）表明重組酶的耐熱性較差，在最適溫度下保溫15 min酶活性大約損失一半。

圖6 重組酶最適溫度曲線

圖7 重組酶熱穩(wěn)定性曲線

2.5.4 重組酶的最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定 在不同pH值下對(duì)重組酶活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組酶的最適pH為5.0（圖8）。在將重組酶在不同pH溶液中室溫放置一段時(shí)間，并進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果（圖9）發(fā)現(xiàn)重組酶的pH穩(wěn)定性較好，在pH5.0-6.0的緩沖液中放置20 h后仍有80%以上的酶活力。

圖8 重組酶最適pH曲線

圖9 重組酶pH穩(wěn)定性曲線

3 討論

隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，能源短缺的問(wèn)題日益突出，可再生能源的開(kāi)發(fā)與利用受到了世界各國(guó)的高度重視。淀粉是綠色植物果實(shí)、種子、塊莖、塊根的主要成分，是空氣中二氧化碳和水經(jīng)光合作用合成的產(chǎn)物，是地球上最豐富的貯藏性多糖。然而，大多數(shù)微生物多以葡萄糖、麥芽糖等低聚糖為最適底物，天然淀粉卻不能被有效的利用。將天然淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。糖化酶是水解淀粉的重要酶類之一，它可以水解生淀粉或低聚糖非還原性末端α-1，4-糖苷鍵生成葡萄糖。許多糖化酶水解生淀粉的活性較低且熱穩(wěn)定性差，工業(yè)上在進(jìn)行糖化前需將淀粉質(zhì)原料進(jìn)行高溫糊化和液化，并進(jìn)行降溫冷卻，增加了生產(chǎn)成本。開(kāi)發(fā)出酶活性高，耐熱性強(qiáng)的新型糖化酶可大大降低生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。近幾年，國(guó)內(nèi)對(duì)新型糖化酶基因及表達(dá)的研究較少，對(duì)黑曲霉糖化酶基因、表達(dá)及產(chǎn)酶條件的研究較多。2008年，李昆等［20］用黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子PglaA替換質(zhì)粒pRS303K上KmR基因啟動(dòng)子，構(gòu)建成糖化酶基因啟動(dòng)子功能檢測(cè)質(zhì)粒pRS-PglaA-KmR，并將其轉(zhuǎn)化E. coli JM109，通過(guò)對(duì)重組菌的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PglaA在E. coli中具有驅(qū)動(dòng)KmR基因表達(dá)的活性。2011年賀瑩等［21］對(duì)黑曲霉IN7-31產(chǎn)糖化酶的液態(tài)發(fā)酵參數(shù)與技術(shù)優(yōu)化進(jìn)行研究，其搖瓶發(fā)酵糖化酶酶活高達(dá)3 044 U/mL，較優(yōu)化前提高了1.59倍。2012年，王強(qiáng)等［22］將黑曲霉糖化酶基因在畢赤酵母X33中進(jìn)行了成功表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)180 mg/L。本研究采用基因工程技術(shù)手段將粉紅黏帚霉糖化酶基因插入到黑曲霉G1染色體中，并實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)，該重組酶酶活達(dá)292 U/mL，最適溫度和pH分別為50℃和5.0。本研究為后續(xù)新型糖化酶的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為糖化酶的研究提供了一種新的出發(fā)菌株。隨著老一代糖化酶逐漸被新型糖化酶取代，篩選和開(kāi)發(fā)高比酶活、耐高溫或用于生淀粉加工的新型糖化酶基因，對(duì)于淀粉加工產(chǎn)業(yè)和釀酒糖化過(guò)程優(yōu)化等工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)提升提供支持。同時(shí)，新型糖化酶的開(kāi)發(fā)可以打破國(guó)際專利對(duì)傳統(tǒng)糖化酶的保護(hù)壁壘和技術(shù)壟斷，為我國(guó)淀粉質(zhì)原料的降解提供更高效的酶及輔助因子。傳統(tǒng)糖化酶大都存在酶活性不高，耐熱性差等問(wèn)題，在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用中能耗大、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，而開(kāi)發(fā)出酶活性高，耐熱性強(qiáng)的新型糖化酶可大大降低淀粉質(zhì)原料的糖化成本，提高糖化效率。此外，傳統(tǒng)糖化酶的生產(chǎn)菌株大多是野生菌株經(jīng)過(guò)反復(fù)誘變而得到的突變株，在實(shí)際生產(chǎn)中存在著易污染、生產(chǎn)條件復(fù)雜且難以控制等技術(shù)性難題，而新型糖化酶菌株通過(guò)基因工程技術(shù)手段定向構(gòu)建，可有效解決這些問(wèn)題。本研究獲得的重組酶活性有待進(jìn)一步提升，同時(shí)該酶的酶學(xué)性質(zhì)在耐熱方面也需要改善。進(jìn)行密碼子優(yōu)化及高通量篩選，提升重組酶的活性和酶學(xué)性質(zhì)將是下一步研究工作的重心。

4 結(jié)論

本研究首次克隆并報(bào)道了粉紅黏帚霉糖化酶基因，并將其轉(zhuǎn)化到黑曲霉G1中獲得了糖化酶的表達(dá)。120 h搖瓶發(fā)酵后，發(fā)酵液上清糖化酶活性達(dá)292 U/mL。對(duì)重組糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究表明，其最適溫度和pH分別為50℃和5.0，該酶熱穩(wěn)定性較差，pH穩(wěn)定性較好，在pH5.0-6.0的緩沖液中室溫放置20 h后仍有80%的殘余酶活。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Characterization of Glucoamylase from Gliocladium roseum

Zhang Liang1，2Hua Erbing1Wang Huaming2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Glucoamylase from Gliocladium roseum was secretively expressed in Aspergillus niger G1 strain. A putative glucoamylase gene（about 1. 8 kb）was amplified by PCR using genomic DNA of G. roseum as template. The amplified products were ligated into the clone vector pGm to construct recombinant plasmid pGm-3440. The recombinant plasmid transformed into A. niger G1 strain， and amdS screening and PCR validation confirmed that an engineering Aspergillus strain of expressing glucoamylase was obtained. Fermentation of recombinant strain indicated that secretive expression of the glucoamylase gene was available in A. niger， and its enzyme activity was measured by method defined in national standard（QB/T 1803-1993）， and it reached 292 U/mL. Further enzymatic analysis demonstrated that the optimum pH and temperature for the recombinant enzyme were 5. 0 and 50℃， respectively. Meanwhile， it had poor thermal resistance， but promising pH stability.

glucoamylase；Gliocladium roseum；Aspergillus niger G1；secretive expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.029

2014-10-21

“十二五”基礎(chǔ)前沿專項(xiàng)（Y1J4061201）

張 亮，男，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：929850607@qq.com

花爾并，男，博士，教授，研究方向：藥物合成，E-mail：huarb@tust.edu.cn；王華明，男，博士，教授，研究方向：新型工業(yè)酶及表達(dá)系統(tǒng)，E-mail：wang_hm@tib.cas.cn