陳引進　吳德孝　魏富凱　張宇峰

（江蘇警官學(xué)院，江蘇南京　210031）

熒光分光光度法研究可卡因與牛血清白蛋白之間的相互作用*

陳引進吳德孝魏富凱張宇峰

（江蘇警官學(xué)院，江蘇南京210031）

目的：研究不同溫度下可卡因與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用及其作用機制。方法：通過熒光光譜法研究可卡因?qū)SA的熒光猝滅光譜和同步熒光光譜，確定熒光猝滅方式，并根據(jù)熱力學(xué)方程討論兩者間的作用力類型。結(jié)果：可卡因?qū)SA的熒光呈規(guī)律性猝滅，分別用Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk方程和熱力學(xué)方程等分析處理實驗數(shù)據(jù)，求得在不同溫度下反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K分別為1.38×103L/mol （30℃）和6.19×103L/mol（37℃）、結(jié)合位點數(shù)n為1、熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG分別為167.44 KJ/mol、612.71J/mol·K、-18.21 KJ/mol（30℃）和-22.50 KJ/mol（37℃）。結(jié)論：可卡因?qū)SA的熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅。兩者的相互作用力主要是疏水作用力。

熒光光譜法可卡因牛血清蛋白相互作用

可卡因（cocaine）化學(xué)名為苯甲酰甲基芽子堿，又稱古柯生物堿。導(dǎo)致其濫用的主要原因是其強烈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用（欣快感）［1］?？煽ㄒ虻臑E用可導(dǎo)致機體多個系統(tǒng)、臟器的損傷［2］，嚴重者可誘發(fā)心律紊亂、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。對于長期小劑量濫用所致的慢性中毒，主要是心理依賴性反應(yīng)，生理依賴很輕［3］。

血清白蛋白是人和動物血清中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，與各種帶正電荷的物質(zhì)及電中性物質(zhì)均有一定程度的相互作用。各類藥物進入人體首先與血清白蛋白結(jié)合，通過血漿的存貯和運輸，到達受體部位產(chǎn)生藥理作用［4］。研究各種藥物與血清白蛋白的結(jié)合，來獲取藥物分子對蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的影響以及藥物的藥理等有用信息，已經(jīng)引起了生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)科研工作者的普遍關(guān)注。目前研究生物大分子與藥物小分子相互作用的方法主要有熒光光譜法［5］、紫外光譜法［6］、圓二色譜法［7］、拉曼光譜法［8］、電化學(xué)法［9］和核磁共振法［10］等。

熒光光譜法是研究生物大分子與藥物小分子化合物之間相互作用很有效的方法，發(fā)射峰的位置、熒光偏振、能量轉(zhuǎn)移、熒光壽命等指標(biāo)均可以對蛋白質(zhì)中熒光發(fā)色團的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有用的數(shù)據(jù)信息［11］。

本文采用熒光光譜法，在模擬生理條件下，定性研究可卡因與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用機理，分析其作用力類型，確定其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，再通過同步熒光法確定可卡因?qū)SA構(gòu)象的影響方式，進而分析可卡因?qū)θ梭w的作用和運轉(zhuǎn)代謝情況，獲得蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及其變化和可卡因的藥理效應(yīng)等信息。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer型熒光分光光度計（Aglient Technologies）；FA1104N電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海葉拓儀表有限公司）。

1.1.2試劑

牛血清白蛋白（BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸可卡因（BR，公安部物證鑒定中心）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（HCl）（AR，上海久億化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（NaCl）（AR，西隴化工股份有限公司）。

1.1.3溶液配置

牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準儲備溶液：準確稱取純度大于99%的牛血清白蛋白0.335g于50ml容量瓶中，以pH=7.4的0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液（其中含0.1mol/LNaCl維持離子強度）定容為50ml，濃度為1.0×10-4mol/L，低溫（≤4℃）保存于冰箱。

可卡因標(biāo)準儲備溶液：用電子天平準確稱取4mg標(biāo)準品于100ml的容量瓶中，以pH=7.4的Tris-HCl緩沖液（其中含0.1mol/ LNaCl維持離子強度）溶解并定容，濃度為40.0μg/mL，低溫（≤4℃）保存于冰箱。

實驗時所需濃度由Tris-HCl緩沖溶液（pH=7.4，內(nèi)含0.1mol/ LNaCl維持離子強度）稀釋而得。所用試劑均為分析純，實驗用水為怡寶純凈水。

1.2實驗方法

于編號為0-7的4mL離心管中分別加入2mL1.0×10-4mol/L的BSA溶液，使用移液槍分別加入的40mg/L鹽酸可卡因工作液0、10、20、30、40、50、60、70μL，充分搖勻，并分別在T=30℃和T=37℃的條件下恒溫水浴1h。采用1cm石英比色皿，選擇激發(fā)波長為292.03nm，狹縫寬度均為5nm，光電管負高壓為400V，掃描速率1200nm/min，掃描并繪制300-500nm的熒光光譜，以及固定熒光激發(fā)與發(fā)射的波長差△λ=15nm和△λ=60nm的同步熒光光譜。

2　結(jié)果與討論

2.1熒光猝滅光譜

按照實驗方法分別測定了30℃、37℃溫度下不同濃度的可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臒晒忖绻庾V，30℃時的猝滅光譜見圖1。由圖1可知，隨著可卡因濃度的逐漸增加，牛血清白蛋白的熒光特征峰逐漸降低。這是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸，使其具有內(nèi)源熒光［12］，當(dāng)固定BSA的量而不斷增加可卡因的濃度時，可卡因與BSA之間的相互作用導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光強度有規(guī)律性的猝滅。

2.2熒光猝滅機理及猝滅常數(shù)的測定

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程［13］：

式中，F(xiàn)0和F表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度，［Q］為猝滅劑的濃度，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)（又稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)），Kq是由擴散過程控制的雙分子動態(tài)猝滅速率常數(shù)。τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10-8s［14］。

圖1　曲線0-7分別對應(yīng)可卡因的濃度為0、0.586、1.165、1.740、2.308、2.871、3.428、3.981 μ mol/L；BSA的濃度為1.0×10-4mol/L

圖2　可卡因與牛血清白蛋白相互作用在30℃和37℃時的Stern-Volmer方程

圖3　可卡因與牛血清白蛋白相互作用在30℃和37℃時的lg［（Fo-F）/F］-1-lg［Q］-1圖

靜態(tài)猝滅過程遵循下式：

式中，Ks是靜態(tài)猝滅常數(shù)（即配合物的締合常數(shù)）。隨溫度升高動態(tài)猝滅常數(shù)增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)減小，可由此判斷熒光猝滅類型。

以F0/F對相應(yīng)的［Q］作圖，得到可卡因?qū)SA之間猝滅的Stern-Volmer曲線，繼而得到不同溫度下可卡因?qū)SA熒光猝滅的Stern-Volmer方程。由Stern-Volmer方程得到在30℃和37℃時Ksv分別為：Ksv30=2.1162×104；Ksv37=1.3099×104。

由于生物大分子的熒光壽命約為10-8s，由方程：

可以得到不同溫度下的可卡因和BSA之間猝滅過程的速率常數(shù)Kq數(shù)量級均為1012。Kq大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/mol·S［15］，所以加入可卡因?qū)е翨SA熒光猝滅不是由動態(tài)碰撞引起的，可以初步判斷猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主，而隨溫度升高，Stern-Volmer方程的斜率（即動態(tài)猝滅常數(shù)）逐漸減小，進一步表明猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主。

2.3結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點數(shù)的測定

表1　可卡因與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點數(shù)

表2　可卡因與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

圖4　同步熒光光譜

當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時，其表觀結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點數(shù)n可由下式求得［16］：

式中：K為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合點數(shù)。

對30℃和37℃時的lg［（Fo-F）/F］-1-lg［Q］-1作雙對數(shù)圖，如圖3。

根據(jù)截距和斜率求得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合點數(shù)n（見表1）。由表可知在實驗條件下結(jié)合位點數(shù)n接近1，說明鹽酸可卡因與BSA可形成1個結(jié)合點數(shù)。而在30℃和37℃時的K值處于同一數(shù)量級，則更加印證了可卡因?qū)SA的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。

2.4BSA與可卡因結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)和作用力的確定

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等4種。當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變ΔH可認為是常數(shù)。根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)參數(shù)焓變△H和熵變△S的相對大小，可以確定分子間的相互作用力類型：當(dāng)△H＜0，△S＜0為氫鍵和范德華力；而當(dāng)△H＜0，△S>0為靜電引力；△H>0，△S>0時為疏水作用力［5］。由熱力學(xué)公式：

結(jié)合K，分別計算出不同溫度時可卡因與BSA作用的自由能變ΔGm、焓變ΔHm和熵變ΔSm（結(jié)果見表2），可得30℃，37℃時的可卡因和BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔH均為167.44KJ/mol，自由能變（ΔG）分別為-18.21，-22.50KJ/mol，ΔS均為612.71J/mol·K。

根據(jù)Ross等總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律［17］，推斷出可卡因與BSA之間的作用力以疏水作用力為主。

2.5同步熒光光譜

對于蛋白質(zhì)的同光熒光光譜，△λ=15nm時僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光，△λ=60nm時則顯示色氨酸殘基的熒光。因芳香族氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與所處環(huán)境極性有關(guān)，若其最大發(fā)射波長改變，說明殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變，由發(fā)射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化［12］。

由△λ為15nm和60nm的同步熒光光譜（如圖4）可知，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征熒光光譜峰均隨可卡因濃度的增加而產(chǎn)生猝滅，但對酪氨酸和色氨酸特征峰的位置影響不大，表明可卡因?qū)εＱ宓鞍讟?gòu)象的改變不大［18］。相比之下，色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基更顯著，表明結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基。

在可卡因與牛血清白蛋白相互作用的過程中，隨可卡因濃度升高，牛血清白蛋白的熒光強度呈有規(guī)律下降。在可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臒晒忖邕^程中，隨溫度升高，猝滅常數(shù)降低，猝滅方式為靜態(tài)猝滅。兩者以物質(zhì)的量比1：1結(jié)合，作用力類型為疏水作用力；同步熒光掃描結(jié)果顯示，可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臉?gòu)象影響不大，兩者的結(jié)合點可能位于色氨酸上。

3　結(jié)語

本文采用熒光光譜法研究可卡因與牛血清白蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明：可卡因?qū)SA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，兩者相互作用的結(jié)合常數(shù)K分別為1.38×103L/mol（30℃）和6.19×103L/mol（37℃）、結(jié)合位點數(shù)n為1、熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG分別為167.44KJ/ mol、612.71J/mol·K、-18.21KJ/mol（30℃）和-22.50KJ/mol（37℃）。根據(jù)分子間相互作用力和熱力學(xué)參數(shù)間的關(guān)系，可推斷兩者的相互作用力主要是疏水作用力。從同步熒光光譜法可知：由于兩者之間的反應(yīng)，BSA的熒光強度顯著降低，并推測可卡因和BSA的結(jié)合點位于色氨酸殘基上。

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Objective To study the interaction of bovine serum albumin（BSA） with cocaine at different temperature and mechanisms underlying. Methods The quenching of fluorescence was determined by measuring fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectra of BSA interacted with cocaine.The type of binding foece was estimated according to the themodynamic equation.Results The fluorescence of BSA interacted with cocaine was quenched regularly .The values of binding constants（Ks）to be 1.38×103L/mol （30℃），and6.19×103L/mol （37℃），amounts of binding sites（1），and themodynamic parameters（ΔH： 167.44 KJ/mol，ΔS： 612.71J/mol·K ，ΔG： -18.21 KJ/mol（30℃）and-22.50（37℃））were obtained by analyzing and processing the fluorescence quenching data according to Stern-Volmer equation， Lineweaver-Burk equation and themodynamic equation，respectively.Conclusion It was shown that the fluorescence quenching process of BSA with Cocaine was attributed to static quenching. The force of the reaction was mainly due to hydrophobic action.

Fluoro-spectroscopy； Cocaine；Bovine serum albumin；Interaction

?馬紅霞.可卡因毒性研究.

1003-8507（2007）11-2091-03

R996

c.

本文系江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃一般項目立項課題論文（項目編號：201410329023y），并受江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（PAPD）資助。指導(dǎo)老師：王虹，江蘇警官學(xué)院高級實驗師；王軍，江蘇警官學(xué)院教授。

陳引進（1992—），男，漢族，江蘇鹽城人，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系法化學(xué)專業(yè)在校生；魏富凱（1994—），男，漢族，江蘇鎮(zhèn)江人，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系法化學(xué)專業(yè)在校生；張宇峰（1994—），男，漢族，江蘇無錫人，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系法化學(xué)專業(yè)在校生；吳德孝（1992—），男，漢族，江蘇徐州人，江蘇警官學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系法化學(xué)專業(yè)在校生。