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      遼寧省首次發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺(tái)病毒病

      2015-10-31 05:45:28袁春穎侯春生李貝貝熊成刁青云
      中國(guó)蜂業(yè) 2015年12期
      關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹(shù)蜂場(chǎng)蜂王

      袁春穎 侯春生 李貝貝 熊成 刁青云

      (1遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)督察所,興城125100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京100093)

      遼寧省首次發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺(tái)病毒病

      袁春穎1侯春生2李貝貝2熊成1刁青云2

      (1遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)督察所,興城125100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京100093)

      蜜蜂病毒病是危害蜜蜂健康的重要病原之一。鑒于遼寧地區(qū)部分蜂場(chǎng)蜂群突然大量死亡或新出房蜂不能參加采集任務(wù)的現(xiàn)象,通過(guò)在發(fā)病蜂場(chǎng)采樣,采用RT-PCR方法進(jìn)行病毒檢測(cè),發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺(tái)病毒(Black queen cell virus,以下簡(jiǎn)稱BQCV)普遍存在于大量死亡蜂群。進(jìn)化分析顯示,BQCV遼寧株與吉林株、韓國(guó)株相近,表明此毒株與亞洲株最相近。推測(cè)黑蜂王臺(tái)病毒可能是導(dǎo)致蜂群大量死亡的重要原因之一,為進(jìn)一步探討病原防治提供基礎(chǔ)。

      黑蜂王臺(tái)病毒病,PCR鑒定,蜂群大量死亡

      1 引言

      遼寧省山區(qū)眾多,蜜源豐富,尤其是荊條蜜是我國(guó)優(yōu)質(zhì)蜂蜜之一。但近兩年來(lái),蜂群遭受了嚴(yán)重的損失,尤其是今年春季,大部分蜂場(chǎng)均有報(bào)道蜂群突然死亡或新出房幼蜂不能飛翔,于箱門(mén)前亂爬。前期調(diào)查研究中,曾在中華蜜蜂群中檢測(cè)到中蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒[1],自此,病毒病在遼寧地區(qū)的蜂群開(kāi)始引起關(guān)注。同時(shí),另一個(gè)病毒,黑蜂王臺(tái)病毒,由于其感染子一代的能力較強(qiáng),對(duì)蜂群的危害尤為嚴(yán)重。BQCV在世界許多國(guó)家及我國(guó)蜂場(chǎng)均有報(bào)道,但大多是西方蜜蜂感染此病較多,并且該病毒大多時(shí)候處于隱性感染狀態(tài),即看似健康的蜜蜂可能已經(jīng)感染此病毒,而未被激活。黑蜂王臺(tái)病毒首次于發(fā)育的蜂王病蛹中發(fā)現(xiàn)而得名[2]。最初,BQCV主要引起蜂王幼蟲(chóng)死亡,后來(lái)發(fā)現(xiàn)普遍存在于成蜂及幼蟲(chóng)體內(nèi)[3],進(jìn)一步研究又發(fā)現(xiàn)感染微孢子蟲(chóng)的蜜蜂更易檢測(cè)到BQCV[4]。BQCV不僅能垂直傳播,而且能水平傳播,由于蜂王是唯一產(chǎn)后代的個(gè)體,因此對(duì)整個(gè)蜂群的危害是相當(dāng)嚴(yán)重的。

      在國(guó)外,Allen[5]等人最先報(bào)道了BQCV的基本特征及分布,隨即又發(fā)現(xiàn)微孢子蟲(chóng)與BQCV的互作將極大增強(qiáng)了BQCV的致病力[6],繼而發(fā)現(xiàn)其他寄生,如蜂螨也能有效傳播BQCV,并增強(qiáng)其危害性[7]。2000年,BQCV的全基因組序列公布[8],大大推動(dòng)了BQCV的研究進(jìn)展。繼而在我國(guó)蜂群中也普遍檢測(cè)到BQCV的存在[9-11]。最近,楊倩等[12,13]報(bào)道BQCV吉林株的全基因組序列,為深入研究BQCV的分布及危害奠定基礎(chǔ)。近兩年遼寧省部分蜂群發(fā)病頻率較高,原因未明,還未見(jiàn)在遼寧有BQCV報(bào)道。本研究通過(guò)采集病蜂樣本,采用RT-PCR方法檢測(cè)病毒BQCV,為探明BQCV在遼寧地區(qū)的危害及分布奠定基礎(chǔ)。

      2 材料與方法

      2.1樣本采集

      采自遼寧省不同地區(qū)近15個(gè)蜂場(chǎng)的健康蜂及巢門(mén)前的爬蜂,樣品的采集是基于蜂農(nóng)發(fā)現(xiàn)蜜蜂大量死亡或爬蜂,采集的樣品快速冷凍低溫保存。蜂種主要包括意大利蜜蜂和中華蜜蜂。

      2.2RNA提取

      將大約20只蜜蜂置于15 ml無(wú)菌管中,在組織勻漿設(shè)備進(jìn)行研磨,至細(xì)末狀,加入適量的Trizol總RNA提取試劑,室溫放置10 min后,于12000 rpm下離心15 min,取沉淀加入1 ml 75%酒精清洗,詳細(xì)步驟按RNA提取試劑盒說(shuō)明操作。提好的總RNA溶解于20 μl的TE緩沖液并貯存于-20℃冰箱中備用。

      2.3RT-PCR

      PCR反應(yīng)總體積為20 μl。其中提取蜜蜂的總RNA為模板,以Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,2×Taq Mix(天根,北京)及引物“TGG TCA GCT CCC ACT ACC TTA AAC”和“GCA ACA AGA AGA AAC GTA AAC CAC”產(chǎn)生677 bp的片段[14]。擴(kuò)增反應(yīng)體系為:cDNA模板為1 μl,上、下游引物各1 μl,反應(yīng)緩沖液10 μl,無(wú)菌水7 μl。反應(yīng)條件為:94℃3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共33個(gè)循環(huán),72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg/ml溴化乙錠)進(jìn)行檢測(cè)鑒定。陽(yáng)性鑒定子通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物獲得其基因序列。進(jìn)化樹(shù)分析采用在線生物分析工具進(jìn)行。

      3 結(jié)果

      3.1BQCV基因擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

      BQCV基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析,在700bp左右可見(jiàn)清晰特異性條帶,大小與預(yù)期相符,如圖1。

      圖1 BQCV電泳鑒定圖(M:100bp DNA Marker;1:BQCV目標(biāo)產(chǎn)物)

      3.2BQCV進(jìn)化樹(shù)分析

      利用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)在線構(gòu)建工具(http://www. phylogeny.fr/simple_phylogeny.cgi?workflow_id=4010ce38 ce27ca7b88986ab861c50ea8&tab_index=6&go_next=1# anchor),采用最大相似然法,對(duì)已克隆并測(cè)序的BQCV遼寧株與來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的其他已報(bào)道BQCV毒株構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示,BQCV遼寧株與吉林株、韓國(guó)株在同一族,表明其進(jìn)化關(guān)系最為相近,屬于典型的亞洲型毒株。

      圖2 BQCV部分序列的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。黑點(diǎn)代表本研究擴(kuò)增得到的BQCV部分序列

      4 討論

      本檢測(cè)首次報(bào)道了遼寧地區(qū)蜜蜂感染黑蜂王臺(tái)病。雖然目前檢測(cè)到BQCV存在于遼寧的大部分蜂群中,但并不代表之前未有感染??赡苁怯捎谥暗臋z測(cè)手段有限,也有可能是BQCV大部分處于隱性感染狀態(tài),而未被激活。本研究檢測(cè)到了BQCV,并且可能是導(dǎo)致蜂群大量死亡的重要原因之一,但還不清楚什么原因?qū)е翨QCV的增殖或成為顯性感染,原因仍需進(jìn)一步探討。

      本研究不僅檢測(cè)BQCV可能是影響遼寧地區(qū)蜜蜂健康新的威脅,而且也為BQCV的快速檢測(cè)提供了可借鑒的方法。尤其是對(duì)于隱性感染的病毒性疾病診斷可快速、有效的鑒定,為有效控制遼寧地區(qū)病毒病的發(fā)生、傳播提供指導(dǎo)。

      [1]李明,馬鳴瀟,張軼博,等.遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病的RT-PCR檢測(cè).畜牧獸醫(yī)科技信息,2008,12:26-27.

      [2]Bailey L,Woods RD.Three previously undescribed viruses from the honey bee.Journal of General Virology,1974,25:175-186.

      [3]Benjeddou M,Leat N,Allsopp M,et al.Detection of acute of bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR.Appl Environ Microb,2001,5:2384-2387.

      [4]Bailey L.The infection of the ventriculus of the adult honeybee by Nosema apis.Parasitology,1955,1:86-94.

      [5]Allen M F,Ball B V.The incidence and world distribution of honey bee viruses.Bee world,1996,77:141-162.

      [6]Kang Y B,Kim D S,Jang D H.Experimental studies on the pathogenicity and developmental stages of Nosema apis.Korean J Vet Res,1976,16:180-184.

      [7]Ball B V,Allen M F.The prevalence of pathogens in honey bee(Apis mellifera)colonies infested with the parasitic mite Varroa Jacobsoni.Ann Appl Biol,1988,113:237-244.

      [8]Leat N,Ball B,Govan V,Davison S.Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus,a picorna-like virus of honey bees.J Gen Virol,2000,81:2111-2119.

      [9]Li J L,Qin H R,Wu J,et al.The prevalence of parasite and pathogens in Asian honeybees Apis cerana in China.PLoS One,2012,11:e47955.

      [10]Ai H X,Yan X,Han R C.Occurrence and prevalence of seven bee viruses in Apis mellifera and Apis cerana apiaries in China. Journal of Invertebrate Pathology,2012,109:160-164.

      [11]Zhang X,He S Y,Evans J D,et al.New evidence that deformed wing virus and black queen cell virus are multi-host pathogens.Journal of Invertebrate Pathology,2012,109:156-159.

      [12]楊倩,張健,宋戰(zhàn)昀,等.蜜蜂黑蜂王臺(tái)病研究進(jìn)展.病毒學(xué)報(bào),2015,3:318-325.

      [13]楊倩,張健,宋戰(zhàn)昀,等.黑蜂王臺(tái)病毒中國(guó)BQCV-JL1株的分離鑒定及全基因組序列分析.病毒學(xué)報(bào),2015,3:114-123.

      [14]Chunsheng Hou,Hadassah Rivkin,Yossi Slabe,et al.Dynamics of the Presence of Israeli Acute Paralysis Virus in Honey Bee Colonies with Colony Collapse Disorder.Viruses,2014,6:2012-2027.

      國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(CARS-45-SYZ 3)

      袁春穎(1981-),女,高級(jí)畜牧師,從事養(yǎng)蜂生產(chǎn)技術(shù)研究及推廣工作,E-mail:chunying0914@163.com

      刁青云,女,研究員,從事蜜蜂病害研究工作,E-mail:dqyun1@126.com

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