不同途徑移植脂肪來源干細(xì)胞對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠空間記憶的影響

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（300211）吳建國 李宏 徐德生 王德勝 王偉

外傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見疾病，其致殘率及致死率占全身各器官損傷之首。腦創(chuàng)傷后患者常伴有高級認(rèn)知功能障礙，出現(xiàn)不同程度學(xué)習(xí)記憶能力下降，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善腦創(chuàng)傷大鼠的認(rèn)知功能[1]，且有研究認(rèn)為腦損傷局部移植效果優(yōu)于靜脈移植，但實(shí)驗(yàn)多為單次注射移植[2]，本實(shí)驗(yàn)采用脂肪來源干細(xì)胞（adipose tissuederived stem cells，ADSCs）作為移植細(xì)胞。我們研究的內(nèi)容是比較多次尾靜脈移植與腦損傷局部單次移植在改善創(chuàng)傷性腦損傷大鼠空間記憶以及海馬組織中腦源性神經(jīng)生長因子mRNA的表達(dá)之間的差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠3只，體質(zhì)量200g，清潔級Sprague-Dawley大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合2006年中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 液壓打擊裝置（美國弗吉尼亞大學(xué)），小動物立體定向儀（山西萬東醫(yī)療器械廠），ABI 7600 PCR儀(美國ABI公司)，Morris水迷宮, 超凈化工作臺（美國Thermo scientific ），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），RNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司），CD90，CD105，CD73，CD44，CD34，HLA-DR單克隆抗體（美國R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪來源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 參照Zuk等[3]的方法略加改良進(jìn)行，取200g的SD大鼠3只，3%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，無菌條件下取大鼠腹部脂肪組織，用無菌D-Hank's溶液反復(fù)沖洗標(biāo)本，以去除污染物和紅細(xì)胞。然后用I型膠原酶（0.075%）在37℃、150rpm 恒溫振蕩水浴搖床內(nèi)消化樣品30min。以去除細(xì)胞外基質(zhì)，然后用等量體積的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中和膠原酶活性，1200g離心10min，棄去上清，沉淀用紅細(xì)胞裂解液重懸，100目篩網(wǎng)過濾，1200g離心5min，棄上清，沉淀重懸，細(xì)胞懸液用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，以1.5×105/ml接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2，飽和濕度孵箱中過夜培養(yǎng)，然后用PBS反復(fù)沖洗以去除未貼壁的殘存的血細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合時，胰酶常規(guī)消化，細(xì)胞按照1∶3進(jìn)行傳代。第4代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)組織觀察、表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞學(xué)檢測以及成骨、成脂等多向分化培養(yǎng)，并制備成終濃度為以2.0×1012/L的單細(xì)胞懸液，待移植時用。

附表1 傷后28天各組Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果（）

附表1 傷后28天各組Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果（）

注：**P<0.05；*與對照組比較P<0.05；a與（3）比較 P>0.05。

組別（group） 鼠數(shù)（n） 逃避潛伏（s） 空間搜索目標(biāo)象限路程（%） 目標(biāo)象限時間（%） 穿越平臺次（次）假傷組(1) 6 24.33±4.84* 30.67±3.67* 31.00±3.22* 7.83±1.17*對照組(2) 8 47.45±15.36 14.25±2.92 14.75±1.98 2.75±0.771尾靜脈移植(3) 8 35.44±4.88* 26.11±3.10*a 22.78±2.17*a 6.00±1.22*a腦內(nèi)移植組(4) 8 35.17±5.78* 24.56±2.88* 22.11±2.37* 5.78±1.20*P [（3）∶（4）] 0.948 0.542 0.572 0.632 F 7.252** 36.725** 42.577** 26.891**

附表2 各組不同時間BDNF mRNA的表達(dá)（）

附表2 各組不同時間BDNF mRNA的表達(dá)（）

注：**P<0.05；*與（2）比較P<0.05；a與（3）比較 P>0.05。

組別（group） 鼠數(shù)（n） 7d 14d 28d假傷組（1） 5 0.0955±0.0151 0.0844±0.1237 0.0824±0.0086對照組（2） 5 1.3389±0.0948 0.1034±0.1688 0.0952±0.0103尾靜脈移植（3） 5 1.5860±0.1953* 2.3943±0.3346* 1.7405±0.2598*腦內(nèi)移植組（4) 5 2.6606±0.2383* 2.4591±0.2781*a 1.8509±0.2189*a P [（3）∶（4）] 0.028 0.644 0.320 F 213.04** 191.25** 168.40**

附圖1 酶消化法得到的ADSC表面抗原流式檢測結(jié)果（設(shè)定PE顯示為黑色，F(xiàn)ITC顯示為灰色）

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及TBI模型制備 采用側(cè)方液壓打擊法制作大鼠海馬神經(jīng)元創(chuàng)傷模型，打擊能量為1.7～2.2atm[4][5]。將存活的76只大鼠隨機(jī)分為4組：①尾靜脈移植組：20只，分別于傷后1d、3d、7d動物麻醉后，2.0×106ADSCs自尾靜脈注入體內(nèi)；②腦內(nèi)移植組：20只，傷后1d固定于立體定向儀上，常規(guī)備皮消毒后，根據(jù)大鼠立體定向圖譜，通過微量注射器于海馬背側(cè)CA1區(qū)注射2.0×106ADSCs；③對照組：20只，造模成功后不做任何處理；④假傷組：16只，僅行頭皮切開及鉆孔，不做打擊。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 創(chuàng)傷性腦損傷后23d行Morris水迷宮檢測[6]，實(shí)驗(yàn)共5 d，定位航行實(shí)驗(yàn)：記錄每次大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)。每天4次實(shí)驗(yàn)，分別從東南西北4個入水點(diǎn)隨機(jī)放入水池，面向池壁，如在120 s內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)平臺，將其放置于平臺上30 s，每次實(shí)驗(yàn)間隔30 s，取4次測試的平均值做為當(dāng)天的逃避潛伏期。空間搜索實(shí)驗(yàn)：第5天完成定位航行后，撤走站臺，選擇站臺對面入水點(diǎn)，將大鼠面對盆壁放入水中，通過攝像機(jī)記錄大鼠在2min內(nèi)的游泳軌跡，應(yīng)用荷蘭Noldus公司Ethovision水迷宮分析系統(tǒng)計(jì)算大鼠在原站臺所在象限的游泳時間、距離在水池內(nèi)游泳的總時間、總距離的比值百分?jǐn)?shù)和穿越原跳臺次數(shù)以判斷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

附圖2 多系分化后染色結(jié)果：A 成骨分化茜紅素染色，B 成脂分化油紅-O染色（×400）

1.2.4 RT-PCR法檢測BDNF mRNA表達(dá)分別于損傷后7d、14d、28d，4組隨機(jī)各取5只大鼠麻醉處死，開顱取損傷側(cè)海馬組織進(jìn)行RT-PCR相關(guān)檢測，首先抽提總mRNA，以反轉(zhuǎn)錄法(RT法)先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物序列分別為：BDNF：F5’-AGA AGA GGA GGC TCC AAAGG-3’，R5’-AAA CAT CCG AGG ACA AGGTG-3’； 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物長為235 bp 。β-actin ：F5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’，R5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物長為175 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃4 min，94 ℃ 35 s→57℃ 30 s→72 ℃ 30 s ，循環(huán)29次后，于72 ℃延伸7 min，每管適時加入內(nèi)參β-actin引物，內(nèi)參擴(kuò)增30次。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到BDNF mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ADSC的生物學(xué)特征和鑒定

ADSCs的細(xì)胞形態(tài)符合間充質(zhì)細(xì)胞的表現(xiàn)，表面標(biāo)志物流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：P4細(xì)胞CD90，CD105，CD73陽性率分別為（99.02±0.35）%、（98.89±0.64）%、（99.01±0.84）%，而CD44，CD34，HLA-DR陽性率為（1.01±0.34）%，（2.43±0.21）%，（1.34±0.46）%。見附圖1，因此可證明本實(shí)驗(yàn)所獲得的ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原特征，在成骨培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3周后，茜紅素染色陽性(見附圖2-A)；在成脂肪培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3周后，油紅-O染色陽性(見附圖2-B)；這說明所得到的細(xì)胞具有多向分化能力。

2.2 大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測

在Morris水迷宮檢測前,對照組、尾靜脈移植組、腦內(nèi)移植組分別有2只、1只、1只大鼠死亡，各組平均潛伏時間均逐漸縮短，與TBI組相比，尾靜脈移植組以及腦內(nèi)移植組的平均潛伏時間減少，而穿越原平臺次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時間占總時間的百分比增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001) ，而尾靜脈移植組以及腦內(nèi)移植組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05),見附表1。

2.3 RT-PCR檢測各組BDNF mRNA的表達(dá)傷后7d、14d、28d，腦內(nèi)移植組、尾靜脈移植組BDNF mRNA的相對表達(dá)量均高于對照組及假傷組，傷后7d時腦內(nèi)移植組BDNF mRNA的相對表達(dá)量高于尾靜脈移植組，差異有顯著性意義(P< 0.05)，而在14d及28d時腦內(nèi)移植組、尾靜脈移植組兩組之間無顯著性差異(P> 0.05)，見附表2。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷是常見的意外傷害，有較高的致死率和致殘率，且存活的患者也常會出現(xiàn)各種神經(jīng)功能障礙，其中學(xué)習(xí)和記憶障礙等認(rèn)知功能障礙是腦創(chuàng)傷患者最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響該類患者的生活質(zhì)量，目前的治療方法是有限的。應(yīng)用細(xì)胞治療因創(chuàng)傷性腦損傷所造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙是新近發(fā)展起來并極有前景的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療策略之一。ADSCs除了與其他干細(xì)胞相似的自我更新和多潛能性之外，ADSCs還具有避免了免疫排斥反應(yīng)，細(xì)胞來源較廣泛，易于采集、制備、保存、對供體損傷小以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源性基因等優(yōu)點(diǎn)[4]。另外ADSCs可通過自體移植，因此不會涉及到社會、倫理及法律等諸多問題，是理想的移植用種子細(xì)胞。目前認(rèn)為間充質(zhì)細(xì)胞治療腦損傷的可能的機(jī)制有促進(jìn)生長因子的分泌，通過細(xì)胞間融合或接觸交換基因和蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)血管生成以及免疫調(diào)節(jié)[7]。

移植移植的成功在很大程度上取決于移植物來源，移植時間窗及移植途徑的選擇。既往研究認(rèn)為經(jīng)尾靜脈移植后細(xì)胞通過血腦屏障最終定植在大鼠腦組織損傷部位的數(shù)目較少，與腦損傷區(qū)移植相比無論是組織學(xué)還是功能學(xué)上治療效果都較之略差，因?yàn)榻?jīng)尾靜脈進(jìn)行細(xì)胞移植，細(xì)胞必須先經(jīng)過體循環(huán)才有可能達(dá)到損傷部位，在這期間大部分細(xì)胞會被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所清除，進(jìn)而傾向于選擇腦損傷區(qū)移植，但腦損傷區(qū)移植可造成二次損傷，Mahmood等[8]研究表明經(jīng)靜脈移植也可明顯改善腦損傷后大鼠的神經(jīng)功能，認(rèn)為MSC移植后主要是通過促進(jìn)各種神經(jīng)生長因子分泌而達(dá)到改善神經(jīng)功能的，本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)尾靜脈多次移植增加移植的細(xì)胞數(shù)和作用時間進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其在定位航行能力和空間探索能力改善、BDNF mRNA的表達(dá)等方面與腦損傷區(qū)移植組間無顯著差異，說明經(jīng)尾靜脈多次移植可以取得與腦損傷區(qū)移植相當(dāng)?shù)男Ч?，且更加安全，對于?fù)合性外傷而言，靜脈移植在改善腦功能的同時，是否有利于其他損傷器官功能的修復(fù)尚需進(jìn)一步研究明確。

總之，ADSCs移植為創(chuàng)傷后因海馬神經(jīng)元損傷而導(dǎo)致的記憶和認(rèn)知功能障礙的改善提供了一種新的治療選擇，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，不同移植途徑在改善空間記憶障礙方面并無顯著差別。