吳清林，鄒水洋，陳雁

（東莞理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞523808）

米根霉直接發(fā)酵玉米粉生產(chǎn)L-（+）-乳酸的研究

吳清林，鄒水洋，陳雁

（東莞理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞523808）

以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395為生產(chǎn)菌，玉米粉為發(fā)酵基質(zhì)，對玉米粉與水兩相分開滅菌冷卻后混合制成玉米粉懸濁液發(fā)酵生產(chǎn)L-（+）-乳酸的新工藝進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，新工藝在不添加任何外源營養(yǎng)的情況下，以150 g/L天然玉米粉為培養(yǎng)基可產(chǎn)L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸對玉米粉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到59.2%，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.4%。該工藝克服了玉米粉在濃度較高情況下由于蒸煮滅菌冷卻后呈凝膠而不能被發(fā)酵的困難；且省去酶解糖化操作，使成本降低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

米根霉；玉米粉；L-（+）-乳酸；新工藝

L-（+）-乳酸是一種重要的化學(xué)品，在食品、醫(yī)藥及化工領(lǐng)域有著廣泛的用途［1］。L-（+）-乳酸的生產(chǎn)可由化學(xué)合成法和發(fā)酵法2種方法實(shí)現(xiàn)。然而該產(chǎn)品如果應(yīng)用于食品或醫(yī)藥領(lǐng)域則發(fā)酵法生產(chǎn)的L-（+）-乳酸較為安全可靠。發(fā)酵法生產(chǎn)L-（+）-乳酸的菌種主要有細(xì)菌和真菌2類微生物，其中真菌自身能夠產(chǎn)生淀粉酶和糖化酶，可直接利用淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵生產(chǎn)的L-（+）-乳酸純凈度較高，而高光學(xué)純度的L-（+）-乳酸是生產(chǎn)可生物降解高分子材料——聚乳酸所必需的［2］。因而利用根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-（+）-乳酸在科研和生產(chǎn)上被廣泛采用。

聚乳酸能否在市場上取代聚乙烯等塑料產(chǎn)品取決于聚乳酸的原料——L-（+）-乳酸的生產(chǎn)成本能否有效降低。近年來人們在以米根霉為菌種發(fā)酵初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)L-（+）-乳酸研究中，圍繞菌種改良、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化以及反應(yīng)器的選擇進(jìn)行了大量的探索，然而在發(fā)酵工藝上始終沒有實(shí)現(xiàn)有效的突破。以農(nóng)產(chǎn)品粗粉或淀粉為基質(zhì)的發(fā)酵在蒸煮滅菌過程中會(huì)導(dǎo)致糊化，濃度高時(shí)冷卻后會(huì)變成凝膠狀，需要液化后才可以進(jìn)行發(fā)酵。Hang等早在1989年就發(fā)文報(bào)道了米根霉可直接發(fā)酵玉米粉生產(chǎn)L-（+）-乳酸的成果［3］，然而，在玉米粉濃度較低時(shí)，蒸煮滅菌冷卻后的基質(zhì)仍處于流質(zhì)狀態(tài)，尚可被米根霉發(fā)酵（這種基質(zhì)與水混合后蒸煮滅菌冷卻后發(fā)酵的工藝方法我們稱之為傳統(tǒng)工藝），但當(dāng)玉米粉濃度較高時(shí)，蒸煮滅菌冷卻后的基質(zhì)呈凝膠狀態(tài)，米根霉則無法將其發(fā)酵。然而低濃度基質(zhì)的發(fā)酵導(dǎo)致L-（+）-乳酸產(chǎn)量低下，這是對能源、設(shè)備等資源的極大浪費(fèi)，不利于降低生產(chǎn)成本。白冬梅等利用玉米生粉不經(jīng)蒸煮滅菌直接進(jìn)行了米根霉L-（+）-乳酸發(fā)酵的嘗試［4］，但雜菌污染成了影響發(fā)酵的主要問題。

為了實(shí)現(xiàn)在較高基質(zhì)濃度條件下的發(fā)酵，我們設(shè)計(jì)了2個(gè)思路：其一是采用生料發(fā)酵，用抗生素抑制雜菌生長（試驗(yàn)取得了良好的效果，將另文報(bào)道）；其二是將發(fā)酵基質(zhì)與水分開滅菌，冷卻后混合，使基質(zhì)在液相中呈懸濁液狀進(jìn)行發(fā)酵（我們把這種固液兩相分開滅菌的方法稱之為新工藝）。新工藝能在較高基質(zhì)濃度下發(fā)酵，且省去了添加外源淀粉酶、糖化酶的酶解糖化操作，對于降低L-（+）-乳酸的生產(chǎn)成本具有重要意義，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1菌種

米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1固體種子培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

碳源+氮源+無機(jī)鹽。

碳源：玉米粉（市售，烘干至恒重后備用）；

氮源（g/L）：2；

無機(jī)鹽（g/L）：KH2PO40.2，MgSO40.1，ZnSO4·7H2O 0.05，CaCO3100。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1種子培養(yǎng)

將米根霉接種到盛有PDA培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中，于28℃下培養(yǎng)5 d～7 d長滿黑色孢子后冷藏。

1.3.2孢子懸液的制備

將長滿黑色孢子的米根霉菌種加入100 mL的無菌生理鹽水稀釋，制成約含有108/mL個(gè)米根霉孢子的孢子懸浮液。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)方法

500 mL三角瓶，加液量100 mL，每瓶接種量5× 106個(gè)孢子，在180 r/min、33℃條件下?lián)u床培養(yǎng)64 h。接種后即加入10 g滅菌CaCO3/瓶。

1.3.4傳統(tǒng)工藝

準(zhǔn)確稱量一定量的玉米粉，加入100 mL水混勻于115℃滅菌30 min，然后按上述1.3.3中的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)。

1.3.5新工藝

準(zhǔn)確稱量一定量的玉米粉盛入500 mL三角瓶中，同時(shí)準(zhǔn)確量取100 mL水于200 mL三角瓶中，分別在115℃滅菌30 min，冷卻后將二者混合制成懸濁液，再按上述1.3.3中的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)。

1.3.6玉米粉雙酶糖分步發(fā)酵培養(yǎng)

準(zhǔn)確稱取15.0 g玉米粉盛入500 mL三角瓶中，加入100 mL水混勻，然后加入0.05 g α-淀粉酶混合均勻后，于恒溫水浴鍋70℃保溫1 h，再加入糖化酶在30℃條件下糖化24 h，制成玉米粉雙酶糖，于115℃滅菌30 min，再按上述1.3.3中的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)。

1.3.7玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)方法與1.3.5新工藝相同，但不添加氮源及除CaCO3外的無機(jī)鹽。

1.4分析方法

1.4.1L-（+）-乳酸鈣的測定

EDTA定鈣法。

1.4.2殘?zhí)堑臏y定

3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。

1.4.3玉米粉水解物總糖含量的測定

采用酸解法將玉米粉中淀粉水解完全后用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量，測得1.000 g干燥的玉米粉水解物總糖含量為0.818 27 g，以下乳酸對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算以此為基準(zhǔn)。

2結(jié)果與討論

2.1不同基質(zhì)濃度條件下新工藝與傳統(tǒng)工藝的比較

對不同玉米粉濃度條件下新工藝與傳統(tǒng)工藝的發(fā)酵情況進(jìn)行了考察。由試驗(yàn)結(jié)果（表1、表2）可以看出：傳統(tǒng)工藝條件下，在玉米粉濃度超過150 g/L時(shí)，由于糊化玉米粉冷卻后變成凝膠狀固化，通氣性、傳質(zhì)性喪失，米根霉不能將其發(fā)酵?；|(zhì)濃度在120 g/L及以下時(shí)，糊化玉米粉還能呈流動(dòng)狀態(tài)，有一定的通氣性，可以被米根霉發(fā)酵。但過低的基質(zhì)濃度勢必造成效率低下，資源浪費(fèi)，不利于總體生產(chǎn)成本的控制。在新工藝條件下，解決了傳統(tǒng)工藝中基質(zhì)濃度較高不能被發(fā)酵的問題，但也并不是玉米粉的濃度越高越好，當(dāng)濃度達(dá)到180 g/L時(shí)，L-（+）-乳酸產(chǎn)量雖有所提高，但轉(zhuǎn)化率降低了。所以新工藝條件下150 g/L的玉米粉是最適宜的基質(zhì)濃度。

表1　不同濃度的玉米粉對米根霉L-（+）-乳酸發(fā)酵的影響（傳統(tǒng)工藝）Table 1Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（traditional technology）

表2　不同濃度的玉米粉對米根霉L-（+）-乳酸發(fā)酵的影響（新工藝）Table 2Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（new technology）

另外我們發(fā)現(xiàn)在新工藝的培養(yǎng)條件下米根霉菌絲體呈現(xiàn)分散的小球狀，類似煮熟綻開的米粒，而在葡萄糖基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)菌絲體呈現(xiàn)一大塊扁平絮狀物。有研究表明，米根霉的球狀菌絲體比團(tuán)塊狀、絮狀更適宜發(fā)酵產(chǎn)酸［5-6］。本試驗(yàn)中米根霉菌絲球的形成可能是玉米顆粒表面的蠟質(zhì)和角質(zhì)可以起到固定化載體的作用，使菌絲體分散，這有利于傳質(zhì)而促進(jìn)發(fā)酵。

2.2玉米粉新工藝發(fā)酵與玉米粉雙酶糖分步發(fā)酵的比較

新工藝屬于直接發(fā)酵，也被稱為同步糖化發(fā)酵，而玉米粉雙酶糖是玉米粉經(jīng)淀粉酶和糖化酶液化及糖化處理后獲得，所以玉米粉雙酶糖發(fā)酵屬于分步糖化發(fā)酵。我們比較了2種工藝的發(fā)酵情況，結(jié)果見表3。

表3　玉米粉新工藝發(fā)酵與玉米粉雙酶糖分步發(fā)酵的比較Table 3New technology of corn flour fermentation compared with the step fermentation of double enzyme sugar hydrolyzed from corn flour

由表3可以看出，玉米粉雙酶糖發(fā)酵的L-（+）-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率高于新工藝，但由于雙酶糖的制備耗時(shí)耗能并使工藝步驟復(fù)雜化以及消費(fèi)昂貴的酶制劑（淀粉酶液化需70℃保溫1 h，糖化酶糖化需30℃保溫24 h），工業(yè)生產(chǎn)條件下不利于生產(chǎn)成本的降低。新工藝L-（+）-乳酸發(fā)酵，在玉米粉濃度150 g/L時(shí)，產(chǎn)量接近90 g/L，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了73.2%，對玉米干粉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了59.9%，也就是新工藝條件下發(fā)酵1 t玉米粉可以得到近600 kg的L-（+）-乳酸。

2.3新工藝條件下玉米粉中添加無機(jī)鹽及氮源與否的比較

玉米粉、大米粉等淀粉質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品是米根霉的天然培養(yǎng)基，其除了主要含有淀粉外還含有蛋白質(zhì)、脂肪以及均衡的維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)，在不添加無機(jī)鹽及氮素營養(yǎng)的情況下同樣能滿足米根霉生活的需要，因此我們在玉米粉中不添加氮源和無機(jī)鹽來考察米根霉的發(fā)酵情況，結(jié)果見表4。

表4　新工藝條件下玉米粉中添加無機(jī)鹽及氮素營養(yǎng)與否的比較Table 4The contrast of cornmeal adding inorganic salts and nitrogen nutrition or not in the new process

由表4可以看出玉米粉在不添加任何外源營養(yǎng)物的情況下，發(fā)酵效果跟對照相比幾乎沒有差別。說明利用玉米粉為基質(zhì)，采用米根霉為菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-（+）-乳酸，可以無需添加無機(jī)鹽以及氮源等因素。這樣就使發(fā)酵工藝進(jìn)一步簡化，成本進(jìn)一步降低。

3結(jié)論

以米根霉為菌種，以不添加任何外源營養(yǎng)物的天然玉米粉為培養(yǎng)基，以固液兩相分開滅菌然后制成玉米粉懸浮液的新工藝進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-（+）-乳酸，克服了傳統(tǒng)工藝固液兩相混合后滅菌基質(zhì)糊化，在較高濃度下呈凝膠狀態(tài)而不能被發(fā)酵的困難。新工藝在不添加任何外源營養(yǎng)的情況下，以150 g/L天然玉米粉為培養(yǎng)基可產(chǎn)L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸對對玉米粉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到59.2%，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.4%。該工藝還可以省去酶解糖化操作，使工藝簡化、成本降低，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。依據(jù)新工藝的思想若能設(shè)計(jì)出相應(yīng)的新型反應(yīng)器，將為新工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供支持。

［1］Martinez F A C，Balciunas E M，Salgado J M，et al.Lactic acid properties，applications and production:a review［J］.Trends in Food Science＆Technology，2013，30（1）:70-83

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［3］Hang Y D.Direct fermentation of corn to L-（+）-lactic acid by Rhizopus oryzae［J］.Biotechnol Lett，1989，11（4）:299-300

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［5］Liao W，Liu Y，F(xiàn)rear C，et al．A new approach of pellet formation of a filamentousfungus-Rhizopusoryzae［J］．BioresourceTechnology，2007，98（18）:3415-3423

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The Study on the Direct Fermentation of Corn to L-（+）-lactic Acid by Rhizopus oryzae

WU Qing-lin，ZOU Shui-yang，CHEN Yan
（College of Chemistry and Environment Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，Guangdong，China）

In the traditional fermentation process of L-（+）-lactic acid production，high amount of corn flour used to be autoclaved with certain amount water together to make growth medium.After cooling down，this medium formed sticky gel，which was hard for further fermentation process.In this study，corn flour was sterilized first，then suspended thoroughly in sterilized water to make the growth medium.With this medium，Rhizopus oryzae NRRL395 was used to produce lactic acid.The results showed that without adding any extra nutrition，88.8 g/L of L-（+）-lactic acid was produced with 150 g/L of corn flour growth medium.The convert rate of corn flour reached 59.2%，and convert rate of glucose reached 72.4%.In this fermentation process，no enzymatic saccharification process was need，reducing the total cost.Therefore，this new fermentation process showed high potential for the production of L-（+）-lactic acid.

Rhizopus oryzae；corn flour；L-（+）-lactic acid；new technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.017

2015-05-19

東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目（19）

吳清林（1963—），男（漢），講師，博士，研究方向：生物化學(xué)工程。