長角血蜱性信息素成分的研究

胡玉紅，張 巖，靳 尚，劉敬澤

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊050024）

Berger[1]首次發(fā)現(xiàn) 2，6-二氯酚（2，6-DCP）為后溝類硬蜱中的吸引性信息素（attractant sex pheromone，ASP）成分，目前確定該成分至少在7屬18種硬蜱中存在[2-5].劉敬澤等[6]在長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）雌蜱提取物中檢測到2，6-DCP，并研究了該成分在不同發(fā)育期的含量變化和生物學(xué)作用[6].2，6-DCP作為蜱類防治的藥物已有成功先例[7].

多年來，人們一直在尋找蜱類性信息素中是否還存在2，6-DCP以外的其他物質(zhì).Hanson等[8]在變異革蜱（Dermacentor variabilis）雌蜱提取物中鑒定出 2，4-DCP，同時(shí)確定2，4-DCP與2，6-DCP的含量比例為1∶9，該物質(zhì)對雄蜱也具有吸引作用，且2，4-DCP可以作為 2，6-DCP 的替代物[9]，2，4-DCP 和 2，6-DCP 對變異革蜱吸血雄蜱、吸血若蜱具有相同的作用[10-11].迄今，僅在革蜱屬（Dermacentor）中有2，4-DCP的報(bào)道.

為闡明其他蜱種中是否存在2，4-DCP，分析該種性信息素成分在蜱類不同發(fā)育期的含量變化，本研究以長角血蜱為對象，對其雌蜱揮發(fā)性ASP的主要成分、生物學(xué)作用等進(jìn)行了分析.

1 材料與方法

1.1 蜱的采集和喂養(yǎng)

長角血蜱采自河北省小五臺(tái)山國家自然保護(hù)區(qū).饑餓的幼蜱、若蜱和成蜱均在兔耳上飽血，非寄生期在人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（26±1）℃，相對濕度75%，6 L（光照）∶18 D（黑暗）.不同發(fā)育期的雌蜱：饑餓期（未吸血）、剛吸血（吸血1 d）、吸血期（吸血 2～3 d）、交配期（吸血 3～5 d）、交配后（吸血 5～7 d）、飽血當(dāng)天（吸血5～7 d），分別取材用于研究.

1.2 樣品制備

將不同發(fā)育期的成蜱20頭分別放入磨口玻璃管中，加入5.0 mL正己烷后，封緊玻璃管，置4℃下充分抽提2h，正己烷重提2次，每次30 min.濃縮定容至20μL，用于生物測定、色譜和質(zhì)譜分析.

1.3 色譜條件

1.3.1 氣相色譜條件

色譜柱為OV-101毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.15μm），氣化室溫度和Fid檢測器溫度為280℃，柱溫為60℃（5 min），以10℃/min升溫至280℃，信號(hào)采集時(shí)間25 min，載氣為高純度氮?dú)?

1.3.2 質(zhì)譜條件

色譜柱為DBS-MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.15μm），氣化室溫度和Fid檢測器溫度為280℃，柱溫為80℃（5 min），然后以10℃/min升溫至280℃，信號(hào)采集時(shí)間25 min，載氣為氦氣.掃描質(zhì)量范圍為30～800 m/z，電子能量為 70 eV.

1.4 生物測定

①用蘸有正己烷的脫脂棉在剛開始吸血雌蜱的體表進(jìn)行擦拭，上、下午各1次；②不做任何處理（作為空白對照）；③在①處理后連續(xù)3 d在雌蜱體表點(diǎn)滴正己烷，每天1μL（作為正己烷對照）；④在①處理后連續(xù)3 d點(diǎn)滴不同發(fā)育期雌蜱體表抽提物，每天1μL；⑤在（1）處理后連續(xù)3 d點(diǎn)滴標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別為2，4-DCP（100 ng）、2，6-DCP（30 ng）和 2 種成分的混合物（100 ng的 2，4-DCP 和 30 ng的 2，6-DCP）.各處理組重復(fù)5次.

2 結(jié)果與討論

2.1 雌蜱不同發(fā)育期體表抽提物的生物學(xué)測定

長角血蜱的生殖行為在吸血3～5 d后進(jìn)行.剛開始吸血的雌蜱經(jīng)正己烷擦拭后生殖行為基本中止，施加不同發(fā)育期雌蜱的體表抽提物后，長角血蜱生殖行為的恢復(fù)程度如表1所示.

表1 不同發(fā)育期雌蜱體表抽提物對交配的影響Tab.1 Effects of extraction from the femaleh.longicornis at different physiological phases on mating behavior

由表1可以看出，從饑餓期開始，隨著雌蜱發(fā)育的成熟，體表抽提物作用于正己烷處理過的長角血蜱后，其完成生殖行為的百分率增大，交配期雌蜱的體表抽提物效果最好.

2.2 氣相色譜/質(zhì)譜分析

根據(jù)不同發(fā)育期的雌蜱體表抽提物的生物測定結(jié)果，選取典型時(shí)期（交配期）樣品進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜分析，結(jié)合2，4-DC與2，6-DCP標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和質(zhì)譜特征.結(jié)果如圖1所示，可知保留時(shí)間9.90 min的成分為2，4-DCP，保留時(shí)間10.53 min的成分為2，6-DCP.

圖1 長角血蜱雌蜱交配期體表抽提物氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography of extraction from the body surfaceof mating femaleh.longicornis

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的生物測定

2，4-DCP與2，6-DCP標(biāo)準(zhǔn)品對交配成功率的效果如表2所示.由表2可以看出，未處理的雌蜱（空白對照）均可飽血，擦拭正己烷后的對照組的雌蜱交配成功率不足10%.雌蜱體表經(jīng)正己烷擦拭后無法完成生殖行為，施加測試樣品后生殖行為得到不同程度的恢復(fù).施加2，4-DCP的處理組飽血率接近70%；施加2，6-DCP的處理組飽血率略高于施加2，4-DCP的處理組，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）.2，4-DCP 與 2，6-DCP混合組分對飽血率的影響高于單獨(dú)施加其中的一種成分的影響，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）.

表2 2，4-DCP和2，6-DCP對雌蜱交配的影響Tab.2 Effects of 2，4-DCP and 2，6-DCP on mating behavior of femaleh.longicornis

2.4 不同發(fā)育期雌蜱2，4-DCP與2，6-DCP分泌量的動(dòng)態(tài)變化

通過外標(biāo)法測定不同發(fā)育期時(shí)雌蜱的2，4-DCP與2，6-DCP分泌量，結(jié)果如表3所示.

表3 雌蜱不同發(fā)育期2，4-DCP和2，6-DCP分泌量的動(dòng)態(tài)變化Tab.3 Dynam ic change of secretion level of 2，4-DCP and 2，6-DCPat different physidogical phases of femaleh.longicornis

由表3可以看出，饑餓期的雌蜱體表已經(jīng)存在2，4-DCP 和 2，6-DCP；吸血開始后，2 種成分的分泌量都開始增加；交配期達(dá)到峰值，此后下降.在所有發(fā)育期，2種成分分泌量的比例關(guān)系基本保持一致.

3 結(jié)論

氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果表明，長角血蜱雌蜱所有發(fā)育期均可分泌2，4-DCP和2，6-DCP，并隨雌蜱發(fā)育期而變化，交配期達(dá)到高峰，高峰后分泌量又逐漸下降，這與劉敬澤等[12]用氣相色譜法在長角血蜱盾窩腺丙酮提取物中檢測的2，6-DCP含量動(dòng)態(tài)變化基本吻合.不同發(fā)育期，雌蜱體表分泌2，4-DCP和2，6-DCP量的比例基本保持不變，約為3∶1，而Hanson等[8]報(bào)道的變異革蜱中該比例為1∶9，這說明不同蜱種間存在差異，可以實(shí)現(xiàn)種間識(shí)別的隔離.

根據(jù)硬蜱的交配行為，吸引性信息素由雌蜱在吸血后直至交配前不斷釋放，刺激并吸引性活動(dòng)的雄蜱對雌蜱準(zhǔn)確定位并完成交配行為.本研究證實(shí)長角血蜱中這2種成分的分泌量動(dòng)態(tài)變化與交配行為相吻合，且均對交配行為的完成有顯著促進(jìn)作用，因此可確定2，4-DCP和2，6-DCP均為性信息素成分，有關(guān)兩種成分的作用機(jī)制及其在蜱類防治中的應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究.

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