基于液相色譜—質譜聯(lián)用技術的多囊卵巢綜合征患者血清脂質組學分析

楊兆鵬等

摘 要 多囊卵巢綜合征是育齡期婦女最為常見的內分泌以及代謝紊亂疾病，是女性不孕的主要原因之一。多囊卵巢綜合征患者臨床存在很大的異質性，其致病機理尚未完全闡明。本研究基于反相液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質譜聯(lián)用技術（RPLC/Q-TOF-MS），對74例多囊卵巢綜合征患者和54例正常女性的血清進行了脂質組學分析，定性鑒別出15類314種脂質化合物。數據采用非參數檢驗尋找潛在的差異化合物， p<0.05為顯著性差異。結果表明：多囊卵巢綜合征患者與正常人相比，不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上調趨勢； 部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下調趨勢。而肥胖多囊卵巢綜合征患者與非肥胖多囊卵巢綜合征患者相比，不飽和脂肪酸、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯上調更為明顯； 溶血性磷脂酰膽堿、部分磷脂酰膽堿下調更為明顯。本研究結果表明，脂質組學是研究疾病分型的有效手段。

關鍵詞 多囊卵巢綜合征； 液相色譜-質譜聯(lián)用； 脂質組學； 脂質代謝異常

1 引 言

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性不孕的主要原因之一，在育齡婦女人群中的發(fā)病率為6%～10%[1]。PCOS主要臨床表現為月經稀發(fā)、慢性無排卵、卵巢多囊性改變，以及多毛癥和黑棘皮癥等，嚴重影響患者的身心健康。PCOS具有非常大的異質性，給診斷帶來困難。Zhao等[2]用代謝組學方法探討了代謝標志物進行PCOS輔助診斷的可能性。

脂質組學是研究生物體內脂質代謝變化以及脂質調控在生命活動中作用的有效手段[3]。液相色譜-質譜聯(lián)用技術是目前主要的研究方法，反相液相色譜法由于柱效高、分離效果好，被廣泛應用于脂質分析中。Hu等[4]將反相液相色譜法應用于p53突變的小鼠血漿研究中，各類脂質均得到了良好分離，線性特性和檢測限也令人滿意。

血脂代謝異常是PCOS患者的臨床表現之一，主要表現為甘油三酯、總膽固醇、極低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低[5]。但是目前尚沒有針對PCOS患者血清的脂質組學研究。本研究采用反相色譜與質譜聯(lián)用（LC-MS）的脂質組學方法，對PCOS患者血清進行了脂質組學研究，希望發(fā)現PCOS患者的差異脂質化合物，為了解患者脂質代謝特征提供幫助。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

采用AcquityTM UPLC 液相色譜儀（美國Waters公司）與5600質譜儀（美國AB SCIEX 公司）聯(lián)用進行脂質組學分析。分別使用正負離子掃描模式對樣本進行檢測，色譜柱為ACQUITY UPLC C8柱（10 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級，Merck公司）； 乙酸銨（HPLC級）、 內標脂肪酸FFA 16-d3和FFA 18-d3（Sigma公司）； 磷脂酰膽堿PC 38∶0、磷脂酰乙醇胺PE 34∶0、溶血性磷脂酰膽堿LPC 19∶0、鞘脂SM 12∶0、甘油三酯TAG 45∶0和神經酰胺Cer 17∶0（美國Avanti Polar Lipids公司）。實驗用水為超純水（Milli-Q，美國Millipore公司）。

2.2 血液樣本采集

采用黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院婦科門診和哈爾濱醫(yī)科大學第一醫(yī)院體檢中心提供的74例PCOS患者血樣和54例正常女性血樣。研究經過黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院機構倫理委員會批準，所有患者都簽署了知情同意書。按照2003年鹿特丹會議提出的排除性標準[6]，在排除了先天性腎上腺皮質增生、庫欣綜合征等疾病之后， 滿足下列3條標準中的兩條即可診斷為PCOS： （1） 稀發(fā)排卵或者不排卵； （2） 高雄激素血癥或高雄激素臨床表現； （3） 卵巢多囊性改變。

正常人在生理月經周期第3～5天采血，PCOS患者在生理月經周期或者孕激素降低第3～5天或者兩側卵巢均無優(yōu)勢卵泡時采血。所有采樣對象在前一天避免劇烈運動，于次日早晨采血。血樣采集后靜置30 min，離心后取血清置于-80℃保存。

根據身高體重指數（BMI），將74例PCOS患者和54例正常女性又分為肥胖組（BMI>23）和非肥胖組（BMI≤23），即4組：非肥胖正常組（36例）、肥胖正常組（18例）、非肥胖PCOS組（39例）、肥胖PCOS組（35例）。

2.3 樣本預處理

配制含內標的甲醇溶液，內標質量濃度分別為：PC 38∶0為0.67 μg/mL，PE 34∶0為0.33 μg/mL，LPC 19∶0為0.33 μg/mL，SM 12∶0為0.17 μg/mL，TAG 45∶0為0.53 μg/mL，Cer 17∶0為0.53 μg/mL，FFA 16-d3為0.67 μg/mL，FFA 18-d3為0.67 μg/mL。

血液樣本的預處理：血樣于4℃下解凍后取40 μL于2 mL離心管中，加入300 μL含有內標的甲醇溶液（冰上操作），渦旋30 s，加入1 mL甲基叔丁基醚，室溫下振蕩1 h。加入250 μL水，渦旋30 s，于4℃以12000 r/min離心10 min。取上清液400 μL于1.5 mL離心管中凍干。復溶時先加入40 μL二氯甲烷-甲醇（2∶1， V/V），再加入120 μL含5 mmol/L乙酸銨的乙腈-異丙醇-水（65∶30∶5， V/V），渦旋30 s，離心后， 取60 μL上清液于裝有內襯管中的玻璃瓶中用于進樣。

質量控制樣本（QC）平行地穿插在整個分析過程中，用于評價整個分析過程的重復性。QC樣本來自全部74例PCOS患者和54例正常女性血樣的混合。用QC樣本平衡儀器，待儀器響應穩(wěn)定后再進行樣本的分析，每10個樣本插入1個QC樣本。

2.4 基于LC-MS的脂質組學分析條件

UPLC條件：流動相A相為含10 mmol/L 乙酸銨的乙腈-水（6∶4， V/V），B相為含10 mmol/L乙酸銨的異丙醇-乙腈（9∶1， V/V）。梯度洗脫程序：0～15.5 min，32% B； 15.5～15.6 min，85%～97% B； 15.6～18.1 min，97% B； 18.1～20.1 min，32% B。流速為0.26 mL/min。柱溫為55℃，樣本室溫度為10℃。進樣量為5 μL。

Mass條件：在全掃獲得一級譜圖的同時進行數據相關采集模式（IDA）獲得二級譜圖。正離子模式掃描范圍為100～1500 Da，質量偏差為50 mDa。離子源霧化氣Gas1和輔助氣Gas2 都為344.75 Pa， 氣簾氣Curtain Gas為241.33 Pa，溫度為500℃，噴霧電壓（Ion spray voltage floating， ISVF）為5500 V。去簇電壓（Declustering potential， DP）為80 V，碰撞能（Collision energy， CE）為35 V。負離子模式掃描范圍為90～1500 Da，質量偏差為50 mDa。離子源霧化氣Gas1 和輔助氣Gas2都為379.23 Pa，氣簾氣為241.33 Pa，溫度為600℃，噴霧電壓ISVF為 -4500 V。去簇電壓DP為 -100 V，碰撞能CE為45 eV。

2.5 數據處理

原始數據采用美國ABSCIEX公司LIPIDVIEWVersion1.2軟件進行定性鑒定，根據保留時間、精確質量數、二級質譜圖進行色譜峰識別。定性的脂質化合物用MultiQuant 2.1軟件進行峰提取，并用相應的內標進行校正。

脂質組學數據和臨床數據利用美國SPSS公司SPSS 16.0軟件進行非參數檢驗，p<0.05表示有顯著性差異。

3 結果與討論

3.1 基于LC-MS的脂質組學分析

本研究采用非靶向的脂質組學方法對74例PCOS患者和54例正常女性的血清進行了脂質組學分析。由于實驗采用的是反相色譜，極性較強的溶血磷脂如溶血性磷脂酰膽堿等先流出，非極性的甘油三酯后流出。同一類別的脂質分子主要是根據脂肪鏈的長短和不飽和度的大小實現分離。正負離子模式下的基峰離子流圖如圖1所示，不同類別的脂質均得到良好分離。

本研究采用IDA掃描模式，在全掃描獲得一級譜圖的同時獲得二級譜圖信息，因此可以快速獲得更為詳細的脂質結構信息。再根據保留時間、精確質量數、二級斷裂規(guī)律，實現定性分析。共檢測到15類脂質代謝物，包括游離脂肪酸（FFA）、溶血性磷脂酰膽堿（LPC）、溶血性磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血性磷脂酰肌醇（LPI）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酸（PA）和鞘磷脂（SM）、神經酰胺（Cer）、糖基化的神經酰胺（HexCer）、膽固醇酯（CE）、二酰甘油（DAG）、三酰甘油（TAG）。鑒定的結果如表1所示。正離子模式下鑒定出249種化合物，負離子模式下鑒定出215種化合物。其中LPC、LPE、PC、PE、SM等150種脂質化合物在正負離子模式下均能檢測，因此最終本研究共定性鑒定出314種脂質化合物。

QC樣本用于評價分析方法的重復性，如圖2所示：正離子模式下RSD<15%的化合物百分比達79.5%，RSD<30%的化合物百分比達93.7%； 負離子模式下， RSD<15%的化合物百分比達63.2%，RSD<30%的化合物百分比達94.4%。說明本法的分析重復性良好，適用于脂質組學研究。

3.2 臨床數據比較

本研究選擇與PCOS患者年齡、BMI指數相匹配的正常人做對照。臨床數據表明，PCOS患者的腰臀比、腰圍顯著高于正常人，此外在多毛評分、黑棘皮發(fā)病率、溢脂發(fā)病率方面也顯著高于正常人； PCOS患者血清泌乳素、睪酮、游離雄激素指數升高，性激素結合球蛋白下降，表明PCOS患者激素代謝紊亂； PCOS患者的空腹葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白下降，表明PCOS患者的糖脂代謝狀況紊亂。

已有的研究表明，肥胖PCOS患者和非肥胖PCOS患者在發(fā)病機理、臨床表現等方面有差異[7]?；诖耍狙芯繉⒓膊〗M和正常組又分為肥胖組和非肥胖組。肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者相比，腰臀比、收縮壓、舒張壓升高； 黑棘皮發(fā)病率，溢脂發(fā)病率、粉刺發(fā)病率升高； 空腹胰島素水平、穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數升高； 低密度脂蛋白、甘油三酯升高，高密度脂蛋白下降； 性激素結合球蛋白下降。

3.3 PCOS差異代謝物的變化趨勢以及可能的生理學意義

在PCOS患者和正常人這兩組中， 對定性鑒定出的314種脂質化合物進行了非參數檢驗（p<0.05認為有顯著性差異），其中66種變化倍率較大（即PCOS組和正常組比值小于0.9和大于1.2）的差異化合物可視化變化結果顯示在熱圖中（圖3）。從圖3可見，相對于正常人，在PCOS患者中，LPC、LPE、部分PC、PI下調； 不飽和脂肪酸UFA、部分SM、DAG以及TAG上調。

此外，應用非參數檢驗研究了肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者在脂質代謝方面的差異，其差異化合物在圖3中以紅色標示。綜合上述兩組對比的結果發(fā)現：LPC、部分PC在PCOS組下調，且在肥胖PCOS組下調更為明顯； UFA、部分SM、DAG、TAG在PCOS組上調，且在肥胖PCOS組中上調更為明顯。

圖3 差異脂類代謝物的熱圖（標記為紅顏色表示在肥胖PCOS患者與非肥胖PCOS患者中有差異）Fig.3 Heat map of differential lipids（Lipids in red show significant difference in obese polycystic ovarian syndrome （PCOS） and lean PCOS）

游離脂肪酸是人體內的儲能物質，臨床上很多疾病的發(fā)生發(fā)展與血清中游離脂肪酸的濃度異常密切相關，脂肪酸還是一些重要生理活動如胰島素分泌過程的的信號分子[8]。本研究發(fā)現，在PCOS患者中，多不飽和脂肪酸（如FFA20∶4， FFA22∶4， FFA22∶5）升高，且在肥胖的PCOS患者中升高更為顯著，結果如圖4A， 4B， 4C所示。許多研究表明，上調的游離脂肪酸含量與胰島素抵抗密切相關[9]。游離脂肪酸可激活C-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路，使胰島素受體底物-1（IRS-1）上的絲氨酸磷酸化水平升高，進而減弱了胰島素靶器官中胰島素信號通路的作用[10]。本研究臨床數據表明，肥胖PCOS患者的空腹胰島素水平較非肥胖PCOS患者顯著升高，這也可能與肥胖PCOS患者游離脂肪酸增高相關。

LPC是脂肪酸誘導產生胰島素抵抗過程中重要的中介物[11]。如圖3所示，PCOS患者與正常人相比，LPC呈下調趨勢，這種變化在肥胖PCOS和肥胖正常人兩組對比中尤為明顯，圖4D，4E，4F清楚地顯示了這一變化。文獻＼[12＼]表明，LPC在葡萄糖轉運、吸收利用等方面發(fā)揮了重要作用，可能成為一種獨立的胰島素信號來調節(jié)體內葡糖糖的含量。有研究表明，在肥胖和2型糖尿病患者體內LPC也成下調趨勢， Barber等[13]發(fā)現，LPC的含量和肥胖呈負相關； Li等[14]發(fā)現，LPC可作為高脂肪膳食引起肥胖的標志物，與野生型的小鼠相比，CYP1B1基因敲除的小鼠的血清中LPC明顯下降。另外CYP1B1對于維持人體內雌激素代謝的穩(wěn)定具有重要作用[15]。PCOS患者的雌激素分泌異常也是其臨床特征之一。由此推測，PCOS患者血清中LPC含量下降，雄激素和雌激素的比例失衡，可能與CYP1B1基因被抑制有關。

圖4G和4H表明，PCOS患者與正常人相比，甘油二酯和甘油三酯增加，與臨床數據中TG含量增高吻合，高濃度的甘油三酯水平可增加PCOS患者患動脈粥樣硬化和冠心病的風險[16]。脂質組學分析發(fā)現，包含多不飽和脂肪酸鏈的TG增高更為顯著。此外，鞘磷脂SM（d18∶0/18∶0）在PCOS患者中顯著上調，在肥胖PCOS患者中上調更為顯著，如圖4I所示。Samad等[17]發(fā)現，鞘磷脂的集聚在動脈粥硬化的發(fā)展過程中有著重要作用。鞘磷脂在低密度脂蛋白LDL中的含量高于在高密度脂蛋白HDL； 從PCOS患者臨床指標可知，低密度脂蛋白LDL上升，高密度脂蛋白HDL下降，這也可能與鞘磷脂的增高相關。

4 結 論

本研究將基于LC-MS的脂質組學分析技術用于PCOS患者的血清研究，發(fā)現PCOS患者與正常人相比，不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上調趨勢，部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下調趨勢。不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯在肥胖PCOS組上調更為明顯； 部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿在肥胖PCOS組下調更為明顯。這些現象表明，PCOS患者脂質代謝異常，且肥胖PCOS患者相較非肥胖PCOS患者的脂質代謝紊亂更為嚴重。本研究的結果提示，PCOS患者，特別是肥胖PCOS患者， 胰島素抵抗和動脈粥樣硬化、冠心病的風險增加。

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