黃正剛，陳啟文，吳星恒

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006）

熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)PML／RARa融合基因在兒童APL微小殘留病中的應(yīng)用

黃正剛，陳啟文，吳星恒

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006）

目的應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）定量檢測(cè)兒童急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocyticleukemia，APL）PML／RARa融合基因，監(jiān)測(cè)患兒微小殘留白血?。╩inimal residual disease，MRD）。方法對(duì)初發(fā)、誘導(dǎo)緩解、鞏固、維持治療中的30例APL患兒進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)及利用FISH進(jìn)行PML／RARa融合基因定量檢測(cè)。結(jié)果30例初發(fā)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)診斷為APL患兒，誘導(dǎo)化療結(jié)束后骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)均完全緩解，F(xiàn)CM檢測(cè)MRD陽性19例，陰性11例，但FISH檢測(cè)PML／RARa融合基因陽性27例，陰性3例。經(jīng)鞏固治療后細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全緩解，F(xiàn)CM檢測(cè)MRD陰性29例，1例持續(xù)陽性最終復(fù)發(fā)；而FISH檢測(cè)有7例PML／RARa融合基因檢查仍呈陽性，其中3例在第一輪維持治療后轉(zhuǎn)陰，4例仍呈陽性，經(jīng)IA方案化療后，1例轉(zhuǎn)陰，3例持續(xù)陽性者最終復(fù)發(fā)。兩種檢測(cè)方法陽性數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。結(jié)論FISH檢測(cè)PML／RARa融合基因較FCM具有更高的敏感度，可以定量檢測(cè)MRD，為早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

熒光原位雜交技術(shù)；急性早幼粒細(xì)胞白血病，兒童；PML／RARa融合基因；微小殘留病灶

急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocyticleukemia，APL）是一種特殊類型的白血病，90%以上患者均存在t（15；17）（q22；q21）的染色體易位，并在分子水平上形成PML／RARa融合基因，成為APL特有的分子遺傳學(xué)標(biāo)志［1］。目前白血病的生存率雖然已明顯提高，但白血病復(fù)發(fā)仍是影響患者長期無病生存的重要因素，主要原因?yàn)樵谕耆徑饣颊叩捏w內(nèi)仍存在微量殘留白血病細(xì)胞（minimal residual disease，MRD）。PML／RARa融合基因在白血病病程中比較穩(wěn)定，可用來監(jiān)測(cè)APL微量殘留白血病細(xì)胞的標(biāo)志［2］。

本研究通過熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院30例兒童APL體內(nèi)PML／RARa融合基因在化療過程中表達(dá)水平的變化，監(jiān)測(cè)APL患兒體內(nèi)MRD，并與流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)相比較，分析MRD與患兒治療反應(yīng)、預(yù)后等方面的相關(guān)性，為及時(shí)臨床用藥及預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 臨床資料

收集本院2008年1月至2013年1月經(jīng)FISH檢測(cè)PML／RARa融合基因陽性的APL 30例，男21例，女9例，平均年齡6.6歲，所有患者均按2010版兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床路徑化療。

2 方法

標(biāo)本采集：分別在誘導(dǎo)治療第30天、鞏固治療后、每輪維持治療前各抽取骨髓液行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、融合基因FISH和FCM檢查。

2.1 FISH檢測(cè)PML－RARA融合基因

2.1.1 骨髓標(biāo)本的收集

將新鮮采集的骨髓1～2 m L置于快速準(zhǔn)備好的肝素抗凝管內(nèi)，并立即顛倒混勻經(jīng)免肝素凝固，在室溫下保存24 h，標(biāo)本中加入甘油可以長時(shí)間保存在－20℃。

2.1.2 標(biāo)本預(yù)處理

1）低滲：用吸管將送檢標(biāo)本轉(zhuǎn)移至15 m L離心管中，1 500 r·min－1離心10 min，去除上清，加入10 m L 4%的氯化鉀低滲液，用吸管用力吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，放置37℃的水浴箱中低滲20 min。

2）預(yù)固定：細(xì)胞低滲后，立即加入細(xì)胞固定劑0.5 m L，用吸管輕輕吹打混勻，在室溫放置2～3 min后，1 500 r·min－1離心10 min。

3）固定：離心后，去除液體，并加入10 m L細(xì)胞固定液10 m L，用吸管輕輕吹打混勻后，使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，室溫放置20 min，1 500 r·min－1離心10 min。離心后去除上清，加入固定液再固定一次，方法同上。

4）滴片：將固定好的標(biāo)本離心去上清后，用固定液調(diào)整到適量密度的細(xì)胞懸液，然后取1滴加到泡酸后的玻片上，并使細(xì)胞形成單細(xì)胞層，并對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。

5）細(xì)胞老化：將制備好的滴片標(biāo)本放置70℃的烤片機(jī)或烤箱中老化2 h。

2.1.3 雜交

1）平衡：將老化的玻片標(biāo)本放置在含2XSSC緩沖液中3 min。

2）梯度脫水：玻片標(biāo)本平衡后，經(jīng)70%、85%以及100%的乙醇梯度脫水3 min，脫水后將玻片平放并使其自然干燥。

3）探針雜交液的準(zhǔn)備：按每張玻片10∶1雜交液配置，取一EP管，按照下面的配方配置雜交液：雜交緩沖液7∶1，去離子水2.7，探針0.3∶1。探針雜交液經(jīng)過混勻后待用。

4）變性：將雜交液加到玻片樣本中央，蓋上蓋玻片，并用指甲油封片（用加鈣底油），然后放置在78℃的水浴箱中變性5 min。

5）雜交：取出雜交變性后的玻片，立即放置在42℃的濕潤的雜交盒中，雜交18～20 h。

2.1.4 洗滌

取出玻片，移去樣品玻片上的蓋玻片，立即放入68℃的0.4XSSC／0.3%NP－40洗滌液中，震蕩1～3 s，洗滌1～5 min后取出，然后放入室溫2XSSC／0.1NP－40洗滌液中，震蕩1～3 s，洗滌30 s后取出，將玻片放置于70%乙醇中3 min后取出，自然干燥。

2.1.5 封片觀察

1）將上述干燥的玻片加上1滴甘油，并蓋上蓋玻片封片。

2）封片后放置10 min，直接用熒光顯微鏡觀察，初發(fā)患者計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，治療后監(jiān)測(cè)MRD計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)果判斷。

2.1.6 結(jié)果分析

正常細(xì)胞可見2個(gè)綠色信號(hào)及2個(gè)紅色的雜交信號(hào)；在細(xì)胞核中如出現(xiàn)的信號(hào)模式為1綠1紅2黃色（1G1R2F），或出現(xiàn)額外的紅色或綠色或1個(gè)單融合的信號(hào)模式為異常。

2.2 FCM檢測(cè)MRD

取肝素抗凝的骨髓，采用Ficoll－Hypaque密度梯度離心法常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，以活細(xì)胞直接免疫熒光法進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測(cè)5×105～5×106個(gè)細(xì)胞。將充分洗滌后的標(biāo)本離心沉淀，除去紅細(xì)胞，加入熒光單抗（Mc Ab）孵育15 min后上機(jī)檢測(cè)。所用的Mc Ab均為美國BD公司提供的直標(biāo)抗體，包括PE標(biāo)記的CD10、CD19、CD13、CD34、CD33及FITC標(biāo)記的HLA－DR、CD14、CD15、CD41。

陽性判定：以CD13、CD33抗原陽性細(xì)胞≥0.1%為陽性，≤0.1%為陰性［3］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

誘導(dǎo)治療第30 d，30例初發(fā)病例經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查均已達(dá)完全緩解，F(xiàn)ISH檢測(cè)PML／RARa融合基因陽性27例；3個(gè)鞏固治療結(jié)束后，30例患兒骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查均為完全緩解，PML／RARa融合基因陽性7例；7例FISH檢測(cè)陽性患兒，在第一輪維持治療后轉(zhuǎn)陰3例，4例連續(xù)陽性者，給予IA方案化療，轉(zhuǎn)陰1例，3例持續(xù)陽性最終復(fù)發(fā)。30例誘導(dǎo)化療結(jié)束骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全緩解患兒；FCM檢測(cè)MRD陽性19例、陰性11例，經(jīng)鞏固治療后FCM檢測(cè)MRD陰性29例，1例持續(xù)陽性最終復(fù)發(fā)。兩種檢測(cè)方法陽性數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005），見表1。

表1 30例APL患兒誘導(dǎo)30 d、鞏固化療后和3輪維持治療FISH和FCM檢測(cè)結(jié)果比較 例

4 討論

APL細(xì)胞存在染色體易位t（15；17）（q22；q21），形成PML／RARa融合基因，表達(dá)PML－RARa融合蛋白，該蛋白是APL發(fā)病的重要分子基礎(chǔ)［4－5］。PML／RARa融合基因是兒童APL中最常見的融合基因，可作為兒童APL診斷、治療、評(píng)估預(yù)后的標(biāo)志。FISH技術(shù)作為一種新的分子遺傳學(xué)技術(shù)，具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確、直觀、方便、定量等特點(diǎn)［6］。

MRD是白血病患者經(jīng)化療達(dá)到臨床完全緩解后體內(nèi)殘留不同數(shù)量的白血病細(xì)胞狀態(tài)，殘留的白血病細(xì)胞是白血病復(fù)發(fā)的根源，因此，定期準(zhǔn)確評(píng)估患者緩解期間體內(nèi)殘余的白血病細(xì)胞數(shù)量有利于對(duì)患者預(yù)后的判斷和治療方案的再選擇，是防止白血病復(fù)發(fā)和提高白血病患者長期生存率的重要措施。MRD目前常用的檢測(cè)手段包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等。初診APL患者體內(nèi)白血病細(xì)胞可達(dá)（1～4）×1012，經(jīng)化療緩解后骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)白血病細(xì)胞≤5%，殘留的白血病細(xì)胞數(shù)仍達(dá)106～108，常規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)就難以檢出MRD［7］。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析因分裂相數(shù)量和質(zhì)量的限制，只能檢測(cè)中期細(xì)胞，因此也不是檢測(cè)MRD的敏感方法。

FISH是應(yīng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記特異染色體上的基因作為探針識(shí)別染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的一種方法，是臨床上檢測(cè)PML／RARa融合基因非常有效的技術(shù)之一，也是監(jiān)測(cè)APL治療效果的敏感方法，在臨床上可用來APL的診斷和監(jiān)測(cè)MRD［8］。

白血病相關(guān)免疫表型（leukemi－aassociated immunophenotype，LAIP）是由系列交叉抗原表達(dá)、抗原表達(dá)不同步、過度表達(dá)、表達(dá)缺乏和（或）異位抗原表達(dá)引起，是區(qū)別白血病細(xì)胞與正常造血細(xì)胞的重要特征。有文獻(xiàn)報(bào)道［9］多數(shù)急性白血病患者復(fù)發(fā)時(shí)至少可以檢測(cè)到1個(gè)治療前的LAIP。因此，臨床上FCM同樣可以作為多數(shù)AML患者殘留病變監(jiān)測(cè)的重要方法。目前廣泛應(yīng)用的四色多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（MP－FCM）檢測(cè)白血病MRD的敏感度可達(dá)10－4，但免疫表型在白血病病程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)換和克隆演變，故可造成假陰性的問題；相對(duì)于MP－FCM而言，F(xiàn)ISH的靈敏度也可達(dá)10－3［10］，且以融合基因作為其檢測(cè)的靶分子穩(wěn)定可靠，不存在表型轉(zhuǎn)換和克隆演變而造成假陰性的問題，是目前MRD首選的檢測(cè)手段。因此，通過FISH技術(shù)定期、定量檢測(cè)APL中的PML／RARa融合基因，可以更靈敏、更精確地反映體內(nèi)白血病細(xì)胞的負(fù)荷及其變化趨勢(shì)，特別是對(duì)處于維持治療期間，用敏感特異的方法定期監(jiān)測(cè)MRD水平，對(duì)預(yù)后的判斷、早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、治療方案選擇、提高長期存活率等具有重要的臨床意義。在本組病例中，誘導(dǎo)化療第30天骨髓FCM檢測(cè)11例陰性，但PML／RARa融合基因檢測(cè)僅3例陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明FISH方法較FCM更加敏感、可靠。

有研究［11］證實(shí)MRD水平較其他預(yù)后因素能更好地反映患者白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性等生物學(xué)因素的綜合效應(yīng)，可作為臨床治療反應(yīng)、疾病控制程度、患者是否達(dá)到分子學(xué)水平緩解的評(píng)估指標(biāo)，較形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、FCM確定緩解更加敏感。本研究通過FISH方法對(duì)30例APL患者誘導(dǎo)化療達(dá)完全緩解后進(jìn)行PML／RARa融合基因定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30例MRD檢測(cè)27例陽性，而FCM監(jiān)測(cè)MRD有19例陽性，提示誘導(dǎo)化療達(dá)到完全緩解能消滅患者體內(nèi)大量白血病細(xì)胞，腫瘤負(fù)荷明顯下降，但絕大部分仍有MRD。在誘導(dǎo)化療緩解后，常規(guī)骨髓形態(tài)學(xué)檢查不能反映患兒體內(nèi)白血病細(xì)胞的負(fù)荷及其變化，但FISH及FCM仍可追蹤到MRD。因此，對(duì)白血病患者需定期、定量監(jiān)測(cè)MRD，密切隨訪，對(duì)MRD持續(xù)陽性或MRD水平逐漸升高的患者應(yīng)及時(shí)予強(qiáng)化治療，以防止復(fù)發(fā)。本組患者維持治療期間采用FCM監(jiān)測(cè)MRD 29例為陰性，1例持續(xù)陽性，經(jīng)IA方案化療后仍陽性最終復(fù)發(fā)；但FISH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)仍有7例標(biāo)本MRD陽性，3例經(jīng)1輪維持治療后，MRD水平轉(zhuǎn)陰，4例持續(xù)陽性者，給予IA方案化療，1例轉(zhuǎn)陰，3例仍持續(xù)陽性最終復(fù)發(fā)；這可能是因?yàn)榛颊唧w內(nèi)白血病細(xì)胞的清除是個(gè)緩慢的、持續(xù)的過程，隨著維持治療的延長，MRD陽性率會(huì)逐漸降低，因此MRD陽性率的消長可作為調(diào)整化療方案的一項(xiàng)指標(biāo)［12］；3例MRD持續(xù)陽性而復(fù)發(fā)，提示這種情況應(yīng)密切觀察，及時(shí)調(diào)整化療方案。有研究［13］結(jié)果顯示PML／RARa融合基因檢測(cè)2次以上陽性者，100%復(fù)發(fā)。在本研究中FCM檢查在鞏固治療后僅1例持續(xù)陽性而復(fù)發(fā)，但FISH檢查仍可檢測(cè)部分病例MRD陽性，二者最終復(fù)發(fā)病例數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明采用FISH監(jiān)測(cè)MRD敏感性及特異性強(qiáng)于FCM檢查。因此，F(xiàn)ISH作為PML／RARa融合基因的監(jiān)測(cè)技術(shù)，具有良好的敏感性及特異性，是兒童APL診斷及定期監(jiān)測(cè)MRD的可靠方法；定期檢測(cè)PML／RARa融合基因可以預(yù)測(cè)病情、及早發(fā)現(xiàn)APL在分子水平的復(fù)發(fā)，及時(shí)干預(yù)、指導(dǎo)臨床治療。本研究中標(biāo)本較少，收集更大的樣本數(shù)進(jìn)一步研究是非常必要的。

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（責(zé)任編輯：鐘榮梅）

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