李志量 張潔塵 徐浩翔 楊永紅 馮素英 王寶璽

·論著·

膽堿能受體激動劑逆轉(zhuǎn)天皰瘡棘層松解的機制研究

李志量 張潔塵 徐浩翔 楊永紅 馮素英 王寶璽

目的 研究膽堿能受體激動劑對天皰瘡棘層松解的逆轉(zhuǎn)作用及其機制。方法 將HaCaT細胞與尋常型天皰瘡IgG（PV-IgG）共培養(yǎng)建成天皰瘡細胞模型后，再加入膽堿能受體激動劑卡巴膽堿共培養(yǎng)，以PVIgG誘導的天皰瘡細胞模型作為對照，通過細胞解離實驗定量分析卡巴膽堿對棘層松解的逆轉(zhuǎn)情況，用免疫熒光方法定性觀察橋粒蛋白變化；分別用RIPA和Triton X-100裂解細胞，得到總蛋白和胞質(zhì)蛋白，用蛋白免疫印跡灰度值定性分析HaCaT細胞表面與黏附相關(guān)的橋粒芯蛋白3（Dsg3）、橋斑珠蛋白（PG）的變化，不同時間點p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、表皮生長因子受體（EGFR）的磷酸化水平；用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測上述細胞表面蛋白在mRNA水平的變化；通過免疫共沉淀方法定性分析Dsg3與PG相互作用的變化情況。結(jié)果 PV-IgG組細胞碎片數(shù)為46.67±2.03，卡巴膽堿組為18.67±2.52，兩組比較，t=11.22，P＜0.01；免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),卡巴膽堿可以逆轉(zhuǎn)PV-IgG所致的橋粒分子內(nèi)化。在天皰瘡細胞模型中，細胞總的Dsg3和PG含量下降，非橋粒部分的Dsg3下降，非橋粒PG含量增加，且Dsg3與PG的相互作用減弱，加入卡巴膽堿后可逆轉(zhuǎn)上述變化?？ò湍憠A也可使Dsg3 mRNA的相對表達量（2-ΔΔCt）由1.428±0.215增加至4.974±0.948（t=3.65，P=0.01），PG mRNA 的相對表達量由1.563±0.247增加至 13.420±1.715（t=6.85，P＜0.01）。磷酸化實驗中，卡巴膽堿可以抑制EGFR磷酸化，而對p38 MAPK磷酸化無明顯影響。結(jié)論 膽堿能受體激動劑卡巴膽堿具有逆轉(zhuǎn)棘層松解的作用，這種逆轉(zhuǎn)作用的機制可能包括：抑制Dsg3和PG內(nèi)化并增加其表達，增強Dsg3與PG的相互作用，抑制棘層松解關(guān)鍵信號EGFR的磷酸化。

天皰瘡；膽堿能激動劑；皮膚棘層松解；橋粒芯糖蛋白質(zhì)3；γ連環(huán)素；HaCaT細胞

天皰瘡是一種由自身抗體引起的自身免疫性皮膚病。系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素大大降低了該病死亡率（10%），但其不良反應(yīng)已成為天皰瘡患者死亡的重要原因［1］。從天皰瘡發(fā)病機制出發(fā)，尋找非激素治療方法成為近年研究的熱點。有觀點認為，除了橋粒芯蛋白途徑之外，乙酰膽堿途徑也在天皰瘡的發(fā)病中發(fā)揮一定作用［2］。天皰瘡患者血清中存在乙酰膽堿受體抗體［3-4］，天皰瘡患者皮損中乙酰膽堿受體的表達、分布發(fā)生了變化［4］。在細胞水平［5］、動物水平［6］及臨床觀察［7］均證實膽堿能激動劑對天皰瘡棘層松解有抑制作用，但確切機制尚不明確。我們在HaCaT細胞構(gòu)建的天皰瘡細胞模型基礎(chǔ)上［8］，對膽堿能激動劑卡巴膽堿（carbachol）逆轉(zhuǎn)棘層松解的機制進行研究。

材料和方法

1.主要實驗試劑：HaCaT細胞系來源于中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所中心實驗室；10%胎牛血清-DMEM培養(yǎng)液（美國life technologies公司）。尋常型天皰瘡IgG（pemphigus vulgaris immunoglobulin G，PV-IgG）和正常人IgG分別由PV患者和正常人血清經(jīng)IgG親和純化得到，濃縮后IgG質(zhì)量濃度為20 g/L，橋粒芯蛋白 3（desmoglein-3，Dsg3）抗體為653 U/ml，Dsg1 抗體為 343 U/ml；IgG 終濃度為 1 g/L。其他主要試劑：卡巴膽堿（美國sigma-Aldrich公司，選取不影響細胞增殖與活力的最高濃度10-4mol/L）；分散酶Ⅱ（美國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；10%Bis-tris預制膠、MOPS電泳緩沖液、上樣緩沖液、trizol、鼠抗人Dsg3抗體（美國life technologies公司）；蛋白預染marker（美國Bio-rad公司）；化學發(fā)光液、IgG親和純化柱、免疫共沉淀試劑盒（Pierce Direct IP Kit 26148）、免疫印跡洗脫液（美國Thermo Fisher scientific）；兔抗人p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷酸化 EGFR抗體（美國Cell Signal Technology公司）；鼠抗人橋斑珠蛋白（plakoglobin，PG）抗體（美國 BD 公司）；RIPA 裂解液、Triton X-100裂解液、HRP標記山羊抗小鼠、HRP標記山羊抗兔IgG抗體（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒（美國普洛麥格生物技術(shù)有限公司）；橋粒芯蛋白抗體檢測試劑盒（日本MBL公司）。

2.實驗分組與處理：HaCaT細胞培養(yǎng)至80%融合后實驗分4組：正常人IgG（NH-IgG）組、PV-IgG組、NH-IgG+卡巴膽堿組、PV-IgG+卡巴膽堿組，qPCR實驗中加一組未經(jīng)任何處理的HaCaT細胞作空白對照。經(jīng)上述處理，作用12 h，收集細胞進行進一步實驗。在檢測細胞因子磷酸化實驗中，PV-IgG分別作用 HaCaT 細胞 30、60、120、180 min，以研究細胞因子磷酸化最高峰的時間點。

3.HaCaT細胞解離實驗：HaCaT細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，加入1 ml 2 U/ml分散酶Ⅱ，37℃孵箱中作用30 min后細胞單層與培養(yǎng)皿分離，但細胞間仍保持緊密連接狀態(tài)；吸除分散酶Ⅱ溶液，加入1 ml PBS，在相同機械力（1 ml移液器勻速吹打10次）作用下，細胞發(fā)生解離，計數(shù)每孔的細胞碎片數(shù)量。每組實驗均重復3次。

4.免疫熒光：HaCaT接種于鋪有細胞專用爬片的12孔板中孵育，細胞經(jīng)各組處理后，以PBS清洗，加入新鮮配置的4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次，每次5 min。加入0.1%Triton X-100作用5 min，并以PBS清洗后加入2%牛血清白蛋白-PBS封閉30 min。加入相應(yīng)抗體室溫孵育1 h；加入二抗后室溫孵育45 min；加入7.5 mg/L Hoechest33342染色10 min標記細胞核，激光共聚焦顯微鏡（FluoViewTMFV1000，Olympus corporation） 下觀察Dsg3、PG蛋白熒光染色。陰性對照以PBS代替一抗。

5.蛋白抽提：各組HaCaT細胞用PBS洗2次后，加入RIPA或Triton X-100裂解液（RIPA可以強效裂解細胞，將膜蛋白和胞質(zhì)蛋白完全抽提，得到總蛋白；Triton X-100是溫和裂解液，無法將緊密連接的橋粒蛋白從胞膜上剝離，可以抽提胞質(zhì)蛋白以及與細胞膜上非橋粒黏附分子，反映的是膜蛋白與細胞膜連接的緊密程度），4℃作用5 min后，用細胞刮將細胞裂解液快速刮于培養(yǎng)皿的一端，吸至離心管中，13 800×g離心 15 min，收集上清并分裝。

6.免疫印跡：蛋白定量后，將等量的提取蛋白分別與4倍上樣緩沖液預混，70℃加熱變性10 min后上樣，每孔上樣量 25 μl，200 V 電泳45 min。轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），濕法轉(zhuǎn)印，300 mA恒流2 h，牛血清白蛋白（BSA）室溫搖床振蕩封閉1 h。與相應(yīng)稀釋度的一抗（β肌動蛋白作為內(nèi)參，磷酸化實驗中，總的p38 MAPK、EGFR作內(nèi)參）在4℃搖床振蕩孵育16 h，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液（TBST）洗滌后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST洗去未結(jié)合的二抗，采用化學發(fā)光法在凝膠成像儀（Bio-rad ChemiDocTMXRS+）上觀察各自條帶。每組實驗均重復3次。

7.不同細胞表面蛋白mRNA表達測定：細胞用PBS洗2次后，TRIzol法提取RNA，蛋白核酸分析儀測定RNA濃度，要求A260/280 nm值為1.7-2.0。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核苷酸（cDNA）；依據(jù)qPCR試劑盒說明擴增目的條帶，引物序列見表1。采用Thermal cycler′s軟件包計算Ct值，分析熒光強度。2-ΔΔCt代表mRNA相對表達量。

8.免疫共沉淀：按照免疫共沉淀試劑盒說明書流程操作，用免疫沉淀裂解液裂解細胞，PG單抗交聯(lián)于瓊脂糖珠，將裂解液中含PG的蛋白復合物沉淀下來，去掉瓊脂（聚）糖小球，將蛋白復合物裂解，進行免疫印跡實驗，以PG為內(nèi)參，觀察不同組別Dsg3的含量差異。

表1 qPCR引物序列

9.統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s描述，兩組間比較用t檢驗。

結(jié) 果

1.卡巴膽堿逆轉(zhuǎn)天皰瘡棘層松解：HaCaT細胞與PV-IgG共培養(yǎng)后，細胞解離實驗顯示，PV-IgG組細胞碎片數(shù)目為46.67±2.03，NH-IgG組為5.00±0.58，兩組比較，n=3，t=19.76，P ＜ 0.01；PV-IgG+卡巴膽堿組細胞碎片數(shù)減少至18.67±1.45，與PVIgG 組相比，t=11.22，P＜0.01；NH-IgG+卡巴膽堿組為4.67±0.88。在免疫熒光實驗中，PV-IgG組Dsg3和PG均出現(xiàn)了細胞內(nèi)聚集現(xiàn)象；PV-IgG+卡巴膽堿組Dsg3與PG均恢復正常的胞膜染色模式（圖 1）。

2.卡巴膽堿影響橋粒分子蛋白質(zhì)水平的表達：HaCaT細胞與PV-IgG共培養(yǎng)后，RIPA裂解液作用下的Dsg3和PG水平下降。在Triton X-100作用下，非橋粒部分的Dsg3水平下降，而非橋粒部分的PG水平升高。在加入卡巴膽堿后上述變化均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，恢復到空白對照組水平。在與NH-IgG共培養(yǎng)的HaCaT細胞中加入卡巴膽堿后，Dsg3和PG總蛋白水平均明顯升高（圖2）。

圖1 卡巴膽堿逆轉(zhuǎn)尋常型天皰瘡IgG（PV-IgG）所致的橋粒芯蛋白3（Dsg3）和橋斑珠蛋白（PG）內(nèi)化 HaCaT細胞在PV-IgG作用下，Dsg3和PG出現(xiàn)內(nèi)化，染色不連續(xù)；在此天皰瘡細胞模型的基礎(chǔ)上加入卡巴膽堿后，Dsg3與PG并不出現(xiàn)內(nèi)化現(xiàn)象，呈現(xiàn)出在胞膜的連續(xù)熒光

圖2 卡巴膽堿對HaCaT細胞橋粒芯蛋白3（Dsg3）和橋斑珠蛋白（PG）蛋白質(zhì)水平的影響 HaCaT細胞在PV-IgG作用下，Dsg3和PG總蛋白含量下降，Triton X-100可溶的Dsg3下降，PG含量升高；在此天皰瘡細胞模型的基礎(chǔ)上加入卡巴膽堿可逆轉(zhuǎn)上述變化。NH-IgG：正常人血清IgG；PV-IgG：尋常型天皰瘡患者血清IgG

3.卡巴膽堿影響橋粒分子mRNA水平的表達：如表2所示，在PV-IgG作用下，HaCaT細胞Dsg3和PG在mRNA水平與NH-IgG組相比無明顯變化（t值分別為1.17和0.54，P值分別為0.29和0.61）。NH-IgG+卡巴膽堿組Dsg3和PG mRNA水平表達均明顯升高，與NH-IgG組相比，t值分別為3.65和3.00，P值分別為0.02和＜0.01；PV-IgG+卡巴膽堿組Dsg3和PG的mRNA水平表達與PV-IgG組相比也明顯升高，與NH-IgG組相比，t值分別為3.65和6.85，P值分別為0.01和＜0.01。

4.卡巴膽堿影響Dsg3與PG之間的相互作用：在免疫共沉淀實驗中，HaCaT細胞在PV-IgG作用下，與PG相互作用的Dsg3明顯減少；在加入卡巴膽堿后，與PG相互作用的Dsg3水平恢復到正常水平（圖 3）。

5.卡巴膽堿影響棘層松解相關(guān)信號分子磷酸化水平：在PV-IgG作用下，HaCaT細胞p38 MAPK和EGFR發(fā)生磷酸化，p38 MAPK的磷酸化早于EGFR的磷酸化，其峰值時間分別在60 min和120 min；在加入卡巴膽堿后，p38 MAPK的磷酸化水平并未發(fā)生變化，而EGFR的磷酸化被完全抑制（圖4）。

表2 卡巴膽堿對尋常型天皰瘡IgG（PV-IgG）作用下HaCaT細胞蛋白橋粒芯蛋白3、橋斑珠蛋白mRNA 表達水平的影響（2-ΔΔCt，±s）

表2 卡巴膽堿對尋常型天皰瘡IgG（PV-IgG）作用下HaCaT細胞蛋白橋粒芯蛋白3、橋斑珠蛋白mRNA 表達水平的影響（2-ΔΔCt，±s）

注：n=4，空白對照：HaCaT細胞不加任何處理；a：與空白對照組比較，P＜0.05。NH-IgG：正常人IgG組

組別 橋粒芯蛋白3 橋斑珠蛋白x±s t值空白對照組 1.117±0.261 1.059±0.209 NH-IgG組 1.076±0.210 0.12 1.875±0.528 1.44 PV-IgG組 1.428±0.215 0.92 1.563±0.247 1.56 NH-IgG+卡巴膽堿組 3.894±0.449 5.35a12.610±3.535 3.26a PV-IgG+卡巴膽堿組 4.974±0.948 3.92a13.420±1.715 7.16a x±s t值

圖3 卡巴膽堿影響HaCaT細胞橋粒芯蛋白3（Dsg3）與橋斑珠蛋白（PG）之間的相互作用 HaCaT在PV-IgG作用下，與PG作用的Dsg3含量下降；在此天皰瘡細胞模型的基礎(chǔ)上加入卡巴膽堿可增加與PG作用的Dsg3蛋白含量。NH-IgG：正常人血清IgG；PV-IgG：尋常型天皰瘡患者血清IgG

圖4 卡巴膽堿處理HaCaT細胞不同時間對棘層松解相關(guān)信號分子p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、表皮生長因子受體（EGFR）磷酸化水平的影響 在HaCaT細胞中加入尋常型天皰瘡IgG（PV-IgG）后，p38 MAPK在60 min時磷酸化水平達到最高，EGFR在120 min時磷酸化水平達到最高；在此天皰瘡細胞模型的基礎(chǔ)上加入卡巴膽堿后，EGFR的磷酸化完全被抑制，而對p38 MAPK的磷酸化水平無明顯影響。p-p38 MAPK：磷酸化p38 MAPK；p-EGFR：磷酸化EGFR

討 論

近年來針對天皰瘡的研究表明，除了橋粒芯蛋白途徑之外，還有其他一些旁路途徑在天皰瘡發(fā)病中也發(fā)揮一定作用；如 PG［9］、斑菲素蛋白［10］等其他橋粒分子，p38MAPK［11］、EGFR［12］等細胞內(nèi)信號分子，以及乙酰膽堿途徑、一氧化碳合酶途徑［13］等。

在HaCaT細胞中加入PV-IgG后，細胞解離實驗測得細胞碎片數(shù)量增多，且Dsg3、PG的熒光染色紊亂，出現(xiàn)向細胞內(nèi)聚集的現(xiàn)象，與以往文獻中報道的棘層松解現(xiàn)象一致［14］。加入卡巴膽堿后，細胞的解離和橋粒蛋白的染色模式均發(fā)生逆轉(zhuǎn)，再次通過細胞實驗證實了卡巴膽堿對棘層松解的逆轉(zhuǎn)作用。值得注意的是，卡巴膽堿不僅使Dsg3的熒光染色模式逆轉(zhuǎn)，Dsg3的熒光強度也明顯增加，結(jié)合隨后的免疫印跡與qPCR結(jié)果，這種熒光強度的增加與卡巴膽堿增加HaCaT細胞Dsg3的表達有關(guān)。

在天皰瘡的細胞模型中，我們觀察到Dsg3和PG的總蛋白量下降，但Dsg3和PG在mRNA水平并未出現(xiàn)明顯變化，因此這種蛋白總量的下降并不代表表達水平的下降，而是由于蛋白內(nèi)化降解所致；非橋粒部分的Dsg3與PG表現(xiàn)出了相反的變化，非橋粒Dsg3的減少可能是由于在PV-IgG作用下形成了Dsg3三聚體，這種三聚體在免疫印跡實驗中相對分子質(zhì)量130 000處無法被檢測到［8］；非橋粒PG的升高是由于PV-IgG作用下橋粒結(jié)構(gòu)松動，PG從細胞骨架脫離從而容易被Triton X-100抽提。免疫共沉淀實驗中，加入PV-IgG后，Dsg3與PG的相互作用減少。加入卡巴膽堿后，上述天皰瘡細胞模型的各種變化都發(fā)生逆轉(zhuǎn)。并且卡巴膽堿在mRNA水平也可以增加Dsg3和PG的表達，從而對穩(wěn)定橋粒結(jié)構(gòu)起到積極作用。

細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路在天皰瘡棘層松解的發(fā)生中發(fā)揮一定作用，既往的文獻中，PV-IgG刺激后信號分子活化次序有所不同［15-16］，我們的研究中，p38 MAPK磷酸化水平在60 min時即可達到頂峰，而EGFR磷酸化水平在120 min時達到頂峰，p38 MAPK的磷酸化發(fā)生在EGFR磷酸化之前，這與Bektas等［15］的研究一致?？ò湍憠A可以完全抑制EGFR磷酸化而對p38 MAPK磷酸化無明顯影響，說明卡巴膽堿可以作用于較下游的信號途徑從而抑制棘層松解。

本研究中，我們通過HaCaT細胞構(gòu)建的天皰瘡細胞模型研究了膽堿能激動劑逆轉(zhuǎn)棘層松解的機制，膽堿能激動劑卡巴膽堿可以通過增加Dsg3、PG的表達，抑制Dsg3、PG內(nèi)化，加強PG與Dsg3的相互作用，抑制EGFR磷酸化等途徑逆轉(zhuǎn)棘層松解。

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Mechanisms underlying the reversal of acantholysis in pemphigus by a cholinergic receptor agonist

Li Zhiliang,Zhang Jiechen,Xu Haoxiang,Yang Yonghong,Feng Suying,Wang Baoxi.Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

s:Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org;Feng Suying,Email:fengsuying2010@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the reversal effect of a cholinergic receptor agonist on acantholysis in pemphigus,and to investigate its mechanism.MethodsHuman HaCaT keratinocytes were co-cultured with pemphigus vulgaris immunoglobulin G （PV-IgG）to establish a cell model of pemphigus,then classified into two groups to be incubated with the cholinergic receptor agonist carbachol for 12 hours（test group）or remain untreated（control group）.Cell dissociation assay was performed to quantitatively estimate the reversal effect of carbachol on acantholysis,and immunofluorescence assay to qualitatively assess the changes of desmosomal proteins.Radio-immunoprecipitation assay（RIPA）lysis buffer and Triton X-100 were used to lyse HaCaT cells to obtain total proteins and cytoplasmic proteins,and Western blot was conducted to determine the expression levels of adhesion-related proteins desmoglein 3（Dsg3）and plakoglobin（PG）on the surface of HaCaT cells,as well as the phosphorylation levels of p38 mitogen activated protein kinase （p38 MAPK）and epidermal growth factor receptor（EGFR）at different time points.Quantitative polymerase chain reaction（qPCR）was performed to detect the mRNA expressions of the above surface proteins,and coimmunoprecipitation assay to qualitatively evaluate the interaction between Dsg3 and PG.ResultsThe number of cell debris was significantly lower in the test group than in the control group（18.67±2.52 vs.46.67±2.03,t=11.22,P＜0.01）.Immunofluorescence assay showed that carbachol could reverse the internalization of desmosomal molecules induced by PV-IgG.In the pemphigus cell model,the levels of total Dsg3 and PG as well as non-desmosomal Dsg3 were decreased,while the level of non-desmosomal PG increased,and the interaction between Dsg3 and PG was attenuated.When the pemphigus cell model was co-cultured with carbachol,these above changes were reversed.Carbachol also increased the mRNA levels（expressed as 2-ΔΔCt）of Dsg3 and PG from 1.428±0.215 and 1.563±0.247 in the controlgroup to 4.974±0.948（t=3.65,P=0.01）and 13.420±1.715（t=6.85,P＜0.01）in the test group respectively.In phosphorylation assay,carbachol inhibited the phosphorylation of EGFR,but had no significant effect on that of p38 MAPK.ConclusionsThe cholinergic receptor agonist carbachol can reverse acantholysis in pemphigus,likely by inhibiting the internalization of Dsg3 and PG,enhancing their expressions and interaction,and suppressing the phosphorylation of the key signaling molecule for acantholysis,EGFR.

Pemphigus;Cholinergic agonists;Acantholysis;Desmoglein 3;gamma Catenin;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.011

國家自然科學基金（81071295）；衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費（201002016）；江蘇省重點實驗室自擬課題（201220009）；北京協(xié)和醫(yī)學院學生創(chuàng)新基金（2013100217）

210042南京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院，江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室

王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org；馮素英，Email：fengsuying2010@aliyun.com

2014-07-23）

（本文編輯：顏艷）