劉賽君 郭梅艷 鄧列華 趙剛 胡云峰 易敏 吳實

硒代蛋氨酸對中波紫外線致HaCaT細胞氧化損傷的保護作用

劉賽君 郭梅艷 鄧列華 趙剛 胡云峰 易敏 吳實

目的 研究硒代蛋氨酸對中波紫外線（UVB）致HaCaT細胞氧化損傷的影響及其可能機制。方法 培養(yǎng)HaCaT細胞，分為4組：①正常對照組，不做任何處理；②硒代蛋氨酸組：分別加入1、10、50、100、200 nmol/L和1 μmol/L硒代蛋氨酸預孵育24 h；③UVB組：30、60、90 mJ/cm2UVB照射；④硒代蛋氨酸+UVB組：不同濃度硒代蛋氨酸預孵育24 h后進行不同劑量UVB照射。采用噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比色法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平。采用析因設(shè)計方差分析、單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，多重比較采用LSD法。結(jié)果析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，UVB照射對細胞增殖活性有抑制作用（F=128.04，P＜0.05），且隨UVB強度增加，細胞增殖活性逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；硒代蛋氨酸預孵育對細胞增殖活性也有影響（F=5.95，P＜0.05），其中10 nmol/L～1 μmol/L硒代蛋氨酸+UVB組與UVB組比較，細胞增殖活性顯著升高（P＜0.05）；UVB照射和硒代蛋氨酸對細胞增殖活性無明顯交互作用（F=1.65，P＞0.05）。30 mJ/cm2UVB照射后，UVB組凋亡率（31.9% ±2.67%）較正常對照組（4.1% ±0.67%）顯著升高（P＜0.05）；而 10、50、100、200 nmol/L和 1 μmol/L硒代蛋氨酸 +30 mJ/cm2UVB 組凋亡率［依次為：（21.9±3.72）%、（17.2±1.67）%、（4.6±0.85）%、（7.5±1.86）%、（13.5±1.95）%］均較30 mJ/cm2UVB組凋亡率顯著下降（P＜0.05）。30 mJ/cm2UVB組與正常對照組相比，SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P＜0.05）；10 nmol/L～1 μmol/L硒代蛋氨酸+30 mJ/cm2UVB組與30 mJ/cm2UVB組比較，SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降（P＜0.05）。結(jié)論 硒代蛋氨酸可以減輕UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷，其機制與增強抗氧化酶活性、減少氧自由基有關(guān)。

紫外線；角蛋白細胞；硒代甲硫氨酸；HaCaT細胞

長期、過量紫外線輻射可致皮膚日曬傷、光老化甚至皮膚腫瘤［1-2］，其中中波紫外線（UVB）是造成皮膚光損傷的主要原因［3］，表皮角質(zhì)形成細胞為其主要靶細胞。UVB引起皮膚光損傷機制復雜，最為重要一點是通過氧化應激產(chǎn)生過多活性氧，破壞細胞膜、線粒體膜及使各種細胞酶類失活，影響相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導和基因表達，導致細胞損傷、細胞凋亡或癌變［4-6］。微量元素硒是機體重要的抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的必需組分，具有抗氧自由基的作用，與人體健康密切相關(guān)。硒代蛋氨酸是一種重要的硒化合物，可作為較安全的有機硒來源。本研究以永生化人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞為實驗對象，觀察硒代蛋氨酸對UVB致HaCaT細胞氧化損傷的影響。

一、材料與方法

1.細胞來源、主要試劑和儀器：HaCaT細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學保藏中心）。MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），硒代蛋氨酸、胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司），胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），超氧化物歧化酶（SOD）活力測試盒、GSH-Px活力測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。倒置相差顯微鏡（日本Olymps公司），UVB燈管（北京電光源研究所），紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠），CO2培養(yǎng)箱（美國Napco公司），可見光分光光度計（德國Perkin Elmer公司），流式細胞儀（美國Coulter公司）。

2.細胞培養(yǎng)及分組處理：HaCaT細胞在37℃、5%CO2條件細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將處于亞融和狀態(tài)的細胞用0.25%胰酶和0.03%EDTA消化傳代，105個/ml細胞密度接種于培養(yǎng)板中。HaCaT細胞分為4組：①正常對照組：不做任何處理；②硒代蛋氨酸組：加入1、10、50、100、200 nmol/L 和 1 μmol/L 硒代蛋氨酸預孵育 24 h；③UVB組：30、60、90 mJ/cm2UVB照射；④不同濃度硒代蛋氨酸+不同劑量UVB組：硒代蛋氨酸預孵育24 h后行UVB照射。每組設(shè)3個復孔，重復實驗3次。

3.UVB照射：用2根平行UVB燈管，波長為308 nm，功率為8 W，光源距培養(yǎng)板垂直距離為6 cm，用UVB紫外線輻照計標定輻照強度為200 μW/cm2。UVB劑量分別為30、60、90 mJ/cm2。照射前吸去細胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，再加入少量PBS覆蓋底面。UVB照射后，棄去覆蓋液PBS，加入MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測各項指標。

4.MTT法檢測細胞增殖活性：向每100 μl培養(yǎng)基中加入5 g/L MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解，室溫下振蕩 15 min，使藍紫色結(jié)晶物充分溶解，選擇490 nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度（A值）。

5.流式細胞儀檢測凋亡率：經(jīng)30 mJ/cm2UVB照射后，分別檢測正常對照組、30 mJ/cm2UVB組、各濃度硒代蛋氨酸+30 mJ/cm2UVB組細胞的凋亡率。將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細胞，以體積分數(shù)80%乙醇固定。PBS清洗細胞3次。于各試驗管中分別加入含50 mg/L Triton的碘化丙錠200 μl，振蕩成單細胞懸液，避光室溫靜置30 min。300目濾網(wǎng)過濾后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

6.SOD、GSH-Px活性及MDA含量測定：HaCaT細胞接受30 mJ/cm2UVB照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行SOD、GSH-Px及MDA測定，嚴格按照試劑盒要求步驟操作。測定管A值=（測定空白管A值）/（標準管A值-標準空白管A值）×標準品濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)。每組3個復孔，重復3次，取平均值。

7.統(tǒng)計學處理：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行析因設(shè)計的方差分析、單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 不同濃度硒代蛋氨酸和不同劑量UVB照射對HaCaT細胞增殖活性的影響（A值，±s）

表1 不同濃度硒代蛋氨酸和不同劑量UVB照射對HaCaT細胞增殖活性的影響（A值，±s）

注：n=3。析因設(shè)計方差分析，UVB 主效應：F=128.04，P ＜ 0.05；硒蛋氨酸主效應：F=5.95，P ＜ 0.05；UVB 與硒蛋氨酸無交互作用：F=1.65，P＞0.05；a：與正常對照組（1.11±0.07）比較，P＜ 0.05；b：與未加硒代蛋氨酸的相同劑量UVB 組比較，P＜0.05

UVB劑量（mJ/cm2）1 nmol/L 10 nmol/L 50 nmol/L 100 nmol/L 200 nmol/L 1 μmol/L 0 1.11±0.07 1.12±0.02 1.11±0.05 1.10±0.06 1.12±0.04 1.09±0.06 1.10±0.06 30 0.72±0.09a 0.71±0.03 0.93±0.04b 0.96±0.12b 1.05±0.06b 1.01±0.03b 0.95±0.03b 60 0.50±0.12a 0.60±0.13 0.75±0.16b 0.82±0.04b 0.90±0.08b 0.87±0.03b 0.79±0.04b 90 0.19±0.03a 0.18±0.02 0.31±0.04b 0.46±0.03b 0.55±0.04b 0.54±0.03b 0.40±0.03b硒代蛋氨酸濃度0

二、結(jié)果

1.硒代蛋氨酸和UVB照射對HaCaT細胞增殖活性的影響（表1）：析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，UVB照射對細胞增殖活性有抑制作用（F=128.04，P＜ 0.05），30、60、90 mJ/cm2UVB組HaCat細胞增殖活性均低于未照光組（P＜0.05），且隨UVB強度增加，細胞增殖活性下降，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；硒代蛋氨酸預孵育對細胞增殖活性也有影響（F=5.95，P＜0.05），其中不同濃度硒代蛋氨酸+UVB組細胞增殖活性高于UVB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。UVB照射和硒代蛋氨酸對HaCaT細胞增殖活性無明顯交互作用（F=1.65，P＞0.05）。見表1。

圖1 不同濃度硒代蛋氨酸對30 mJ/cm2UVB誘導HaCaT細胞凋亡的影響UVB組M1區(qū)出現(xiàn)亞G1峰——凋亡峰；1～100 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB組與UVB組相比，M1區(qū)凋亡細胞逐漸減少；200 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB組和1 μmol/L硒代蛋氨酸+UVB M1區(qū)凋亡細胞逐漸增多

表2 不同濃度硒代蛋氨酸對30 mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞凋亡率、SOD、GSH-Px、MDA 的影響（±s）

表2 不同濃度硒代蛋氨酸對30 mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞凋亡率、SOD、GSH-Px、MDA 的影響（±s）

注：n=3。單因素方差分析：a：與 UVB 組比較，P ＜ 0.05；b：與正常對照組比較，P ＜ 0.05

分組 凋亡率（%） SOD（U/ml） GSH-Px（U/ml） MDA（nmol/ml）正常對照組 4.1±0.67a 63.75±1.47a 38.75±1.81a 1.95±0.12a UVB組 31.9±2.67b 44.01±0.94b 24.50±1.85b 7.65±0.29b 1 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB 28.3±2.36 46.03±0.79 26.01±1.53 6.85±0.27 10 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB 21.9±3.72a 49.24±1.13a 33.56±1.39a 4.05±0.20a 50 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB 17.2±1.67a 53.72±1.41a 34.10±0.98a 4.22±0.16a 100 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB 4.6±0.85a 59.13±0.93a 35.59±1.10a 2.66±0.23a 200 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB 7.5±1.86a 57.87±1.49a 37.01±0.72a 3.12±0.13a 1 μmol/L硒代蛋氨酸+UVB 13.5±1.95a 49.65±1.14a 34.84±1.89a 3.55±0.12a F值 71.75 100.78 36.18 298.29 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.硒代蛋氨酸對30 mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響（表2）：30 mJ/cm2UVB照射后，各組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（ν=7，F(xiàn)=71.75，P＜0.01）；30 mJ/cm2UVB組較正常對照組G1峰降低，出現(xiàn)M1區(qū)亞G1峰——凋亡峰，且凋亡率較正常對照組明顯升高（P＜0.05）；從10 nmol/L濃度開始，各濃度硒代蛋氨酸+UVB組與UVB組比較，M1區(qū)凋亡峰均降低，凋亡率均下降（P＜0.05），其中100 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB組凋亡率最低。見圖1，表2。

3.硒代蛋氨酸對30 mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH-Px活性及 MDA含量的影響（表 2）：30 mJ/cm2UVB照射后，各組SOD、GSH-Px、MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義；UVB組與正常對照組相比，SOD、GSH-Px的活性顯著下降，MDA含量顯著增加（P＜0.05）；從 10 nmol/L 濃度開始，硒代蛋氨酸+UVB組與UVB組比較，SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量顯著下降（P＜0.05），其中100 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB組SOD的活性最高，MDA含量最低，而200 nmol/L硒代蛋氨酸+UVB組GSH-Px的活性最高。見表2。

三、討論

本研究發(fā)現(xiàn)，30、60、90mJ/cm2UVB照射后，UVB組HaCaT細胞增殖活性均顯著低于未照光組，隨UVB強度增加，細胞增殖活性下降，說明UVB照射損傷表皮角質(zhì)形成細胞，且損傷具有輻射劑量依賴性。30 mJ/cm2UVB照射后，UVB組與正常對照組相比，細胞凋亡率升高，MDA含量增高，而抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性顯著下降，說明UVB照射誘導HaCaT細胞凋亡可能與其引起氧化損傷使氧自由基增加及降低抗氧化酶活性有關(guān)。

硒是人體必需的微量元素，適量硒化合物可減輕細胞氧化損傷，具有延緩衰老的作用［7］。硒代蛋氨酸是一種較為安全的有機硒源。Burke等［8］發(fā)現(xiàn)，局部外用硒代蛋氨酸可以減輕紫外線輻射引起的炎癥和色素沉著，并可降低紫外線誘發(fā)的皮膚腫瘤數(shù)量。Rafferty等［9］發(fā)現(xiàn)，硒代蛋氨酸能抑制寬譜紫外線（包括UVB、UVA和少量UVC）輻射引起的原代培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞凋亡。我們的研究發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L～1 μmol/L硒代蛋氨酸具有光保護作用，能減少UVB引起的HaCaT細胞凋亡，增加細胞增殖活性，使SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降。其中以100、200 nmol/L的保護作用最為顯著，與Rafferty等［9］的報道基本一致。一般認為，硒化合物在體內(nèi)主要通過硒蛋白介導其保護作用，人類皮膚細胞表達至少15種硒蛋白，包括谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶家族，均有抗氧化活性，能減緩紫外線對皮膚造成氧化損傷［10］。此外，硒代蛋氨酸可抑制UVB誘導的皮膚細胞P53激活和蛋白聚集［11］，從而阻止細胞凋亡。

本研究證實，硒代蛋氨酸對UVB照射損傷人角質(zhì)形成細胞具有光保護作用，能減輕UVB造成的氧化損傷，我們認為與其能增加抗氧化酶活性、減少氧自由基有關(guān)，但具體的作用機制目前仍未完全清楚，尚待進一步研究闡明。

［1］Chen H,Weng QY,Fisher DE.UV signaling pathways within the skin［J］.J Invest Dermatol,2014,134（8）:2080-2085.

［2］D′Orazio J,Jarrett S,Amaro-Ortiz A,et al.UV Radiation and the Skin［J］.Int J Mol Sci,2013,14（6）:12222-12248.

［3］Jansen R,Wang SQ,Burnett M,et al.Photoprotection:part I.Photoprotection by naturally occurring,physical,and systemic agents［J］.J Am Acad Dermatol,2013,69（6）:853.

［4］Chen L,Hu JY,Wang SQ.The role of antioxidants in photoprotection:a critical review ［J］.J Am Acad Dermatol,2012,67（5）:1013-1024.

［5］康玉英,甄雅賢,顧恒.紫外線對皮膚的影響［J］.中華皮膚科雜志,2007,40（12）:773-775.

［6］邢衛(wèi)斌,付國俊,葉文靜,等.氫氣對中波紫外線致皮膚成纖維細胞氧化損傷的影響［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（6）:424-426.

［7］Burke KE.Photoaging:the role of oxidative stress［J］.G Ital Dermatol Venereol,2010,145（4）:445-459.

［8］Burke KE,Clive J,Combs GF Jr,et al.Effects of topical L-selenomethionine with topical and oral vitamin E on pigmentation and skin cancer induced by ultraviolet irradiation in Skh:2 hairless mice［J］.J Am Acad Dermatol,2003,49（3）:458-472.

［9］Rafferty TS,Beckett GJ,Walker C,et al.Selenium protects primary human keratinocytes from apoptosis induced by exposure to ultraviolet radiation［J］.Clin Exp Dermatol,2003,28（3）:294-300.

［10］Hazane-Puch F,Champelovier P,Arnaud J,et al.Long-term selenium supplementation in HaCaT cells:importance of chemical form for antagonist （protective versus toxic）activities［J］.Biol Trace Elem Res,2013,154（2）:288-298.

［11］Traynor NJ,McKenzie RC,Beckett GJ,et al.Selenomethionine inhibits ultraviolet radiation-induced p53 transactivation［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed,2006,22（6）:297-303.

Protective effect of selenomethionine against ultraviolet B-induced oxidative damage to a human keratinocyte cell line HaCaT

Liu Saijun*,Guo Meiyan,Deng Liehua,Zhao Gang,Hu Yunfeng,Yi Min,Wu Shi.
*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510630,China

s:Deng Liehua,Email:liehuadeng@126.com;Guo Meiyan,Email:guomei04@163.com

Objective To evaluate the effect of selenomethionine （Se-Met）against ultraviolet B（UVB）-induced oxidative damage to human HaCaT keratinocytes,and to explore its possible mechanisms.Methods Cultured HaCaT cells were divided into several groups:normal control group receiving no treatment,Se-Met groups treated with Se-Met at concentrations of 1,10,50,100,200 nmol/L and 1 μmol/L for 24 hours respectively,UVB groups irradiated with UVB of 30,60 and 90 mJ/cm2respectively,Se-Met+UVB groups treated with Se-Met at concentrations of 1,10,50,100,200 nmol/L and 1 μmol/L for 24 hours firstly,then irradiated with UVB of 30,60 and 90 mJ/cm2respectively.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to estimate cellular proliferative activity,flow cytometry to detect cell apoptosis,colorimetry to evaluate superoxide dismutase （SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）activities and to determine malondialdehyde （MDA）levels.Statistical analysis was carried out by using factorial design analysis of variance（ANOVA）,one-way ANOVA and least significant difference（LSD）test.Results Factorial design ANOVA showed that UVB radiation had an inhibitory effect on the proliferative activity of HaCaT cells（F=128.04,P＜0.05）,which significantly decreased along with the increase of UVB doses,with significant differences between the three UVB groups（P ＜ 0.05）.Se-Met pretreatment also affected cellular proliferative activity（F=5.95,P ＜0.05）,which was significantly increased in Se-Met （10 nmol/L-1 μmol/L）+UVB groups compared with the UVB groups at corresponding doses（allP＜0.05）.There was no significant interaction effect on cellular proliferative activity between UVB radiation and Se-Met pretreatment（F=1.65,P ＞ 0.05）.The apoptosis rate of HaCaT cells in the 30-mJ/cm2UVB group was 31.9%±2.67%,significantly higher than that in the normal control group（4.1%±0.67%,P＜0.05）and in the 10-,50-,100-,200-nmol/L and 1-μmol/L Se-Met+30-mJ/cm2UVB groups（21.9% ±3.72%,17.2% ±1.67%,4.6% ±0.85%,7.5%±1.86%and 13.5% ±1.95%respectively,allP＜0.05）.Similarly,SOD and GSH-Px activities were significantly weaker（bothP＜0.05）,while MDA levels were higher （allP＜0.05）in the 30-mJ/cm2UVB group than in the normal control group;however,there was a significant increase in SOD and GSH-Px activities but a decrease in MDA levels in the Se-Met（10 nmol/L-1 μmol/L）+30-mJ/cm2UVB groups compared with the 30-mJ/cm2UVB group （allP＜ 0.05）.Conclusions Se-Met can reduce UVB-induced oxidative damage to HaCaT cells,likely by enhancing antioxidase activity and decreasing oxygen radicals.

Ultraviolet rays;Keratinocytes;Selenomethionine;HaCaT cells

作者單位：510630廣州，暨南大學附屬第一醫(yī)院皮膚科（劉賽君、鄧列華、趙剛、胡云峰、易敏、吳實）；河北工程大學附屬醫(yī)院（郭梅艷）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.012

鄧列華，Email：liehuadeng@126.com；郭梅艷，Email：guomei04@163.com

2014-09-05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）