邱蓉麗，吳玉蘭，樂 巍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023)

陳皮和青皮均為中醫(yī)臨床常用理氣藥，陳皮來源于蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的成熟果皮，青皮來源于橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的幼果和未成熟果皮。雖然兩者原植物相同，但由于采收時(shí)間不同，其臨床功效差異較大。古人對(duì)此早有認(rèn)識(shí)，陳嘉漠《本草蒙荃》曰“青皮、陳皮一種，因其遲早采收，特分老嫩而立名也。嫩者性酷治下，老者性緩治高”;李時(shí)珍在《本草綱目》中描述“陳皮浮而升，入脾肺氣分;青皮沉而降，入肝膽氣分，一體二用”［1］。

陳皮、青皮中主要含兩種類型的黃酮類成分:一類是黃酮苷類，如柚皮苷、橙皮苷等二氫黃酮苷類;一類是多甲氧基黃酮類，有橘皮素、川陳皮素等［2-4］?！吨袊?guó)藥典》2010年版僅以橙皮苷作為指標(biāo)性成分評(píng)價(jià)陳皮及青皮的質(zhì)量［5］。為了更好地比較青皮、陳皮藥材中黃酮類成分的差異及其對(duì)功效的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇2個(gè)黃酮苷 (柚皮苷、橙皮苷)、2個(gè)多甲氧基黃酮 (橘皮素、川陳皮素)作為指標(biāo)比較不同產(chǎn)地陳皮、青皮中黃酮，為解釋陳皮、青皮“一體二用”的機(jī)理提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀;Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 材料 陳皮、青皮藥材分別收購(gòu)于浙江，湖北，廣東。浙江、湖北產(chǎn)陳皮、青皮經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院樂巍副教授鑒定為橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮及干燥幼果。廣東產(chǎn)陳皮、青皮購(gòu)于廣東新會(huì)，經(jīng)鑒定為茶枝柑Citrus retculata Chachi的干燥成熟果皮及干燥幼果。橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷 (naringin)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110721-200613、110722- 200610;川陳皮素 (nobiletin)和橘皮素(tangeretin)對(duì)照品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為071209和071126，上述2種對(duì)照品的純度均大于98%。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水(娃哈哈)，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件 Waters xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸水，梯度洗脫 (0～20 min，10% ～25%乙腈;20～35 min，25% ～70% 乙腈;35～ 38 min，70%～95%乙腈);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm;進(jìn)樣量10 μL。在該條件下，對(duì)照品、青皮藥材、陳皮藥材色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取陳皮藥材粉末 (過60目篩)0.5 g，精密稱定。精密加入50 mL甲醇，精密稱定，超聲提取30 min，稱定補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻。溶液經(jīng)微孔濾膜濾過，即得。

圖1 對(duì)照品 (A)、青皮 (B)、陳皮 (C)藥材HPLC分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Citri reticulatae Pericarpium Viride(B)and Citri reticulatae Pericarpium(C)

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷8.65 mg、柚皮苷7.30 mg、川陳皮素3.35 mg、橘皮素4.65 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度分別為 0.865、0.73、0.335、0.465 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取混合對(duì)照品貯備液0.1、0.4、0.6、0.8、1、2、4 mL至10 mL量瓶，甲醇定容，稀釋配制成7個(gè)質(zhì)量濃度水平的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，對(duì)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定。分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的回歸方程分別為Y=21155046X+30186，r=0.9999;Y=19405940X+18898，r=0.9998;Y=21096914X+82019，r=0.9999;Y=24795631X+26100，r=0.9999。結(jié)果表明柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.00730～0.292 mg/mL、0.00865～0.346 mg/mL、0.00335～0.134 mg/mL、0.00465～0.186 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果4種黃酮的峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取新會(huì)廣陳皮藥材6份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定供試品中黃酮。結(jié)果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素平均含有量分別為3.16%、0.033%、0.48%、0.32%，RSD均小于3%，保留時(shí)間RSD均小于3%。表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄4個(gè)黃酮的峰面積。結(jié)果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素和橘皮素的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知各成分含有量的新會(huì)廣陳皮 (橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷分別為 3.2、4.8、31.6、0.33 mg/g)0.25 g，精密稱定。分別精密加入橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷的混合對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度分別為0.995、1.417、1.981、0.132 mg/mL)0.6、0.8、1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.9 樣品測(cè)定 廣陳皮、陳皮、廣青皮、青皮藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算藥材中4種黃酮成分的量。結(jié)果見表2。

由表2可知，各地產(chǎn)陳皮、青皮藥材中4種黃酮類成分均以橙皮苷含有量為最高，柚皮苷含有量最低?！吨袊?guó)藥典》2010年版規(guī)定陳皮中橙皮苷含有量不得少于3.5%，青皮中橙皮苷的量不得少于5%［5］。浙江和湖北產(chǎn)陳皮和青皮中橙皮苷的含有量均符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但這兩個(gè)產(chǎn)地青皮中多甲氧基黃酮川陳皮素和橘皮素的量要遠(yuǎn)大于陳皮。產(chǎn)于廣東新會(huì)的廣陳皮是陳皮的一種，但從測(cè)定結(jié)果看，新會(huì)陳皮、青皮中橙皮苷的量均低于《中國(guó)藥典》2010年版要求，新會(huì)陳皮和青皮中川陳皮素和橘皮素的含有量相差不大。

3 討論

3.1 《本草綱目》引用朱丹溪方曰:青皮治因久積憂郁，乳房?jī)?nèi)有核如指頭，不痛不癢，五七年成癰，名乳癌。用青皮四錢，水一盞半，煎一盞，徐徐服之，日一服，或用酒服［1］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同產(chǎn)地的青皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量均高于陳皮。其中浙江、湖北產(chǎn)的青皮中川陳皮素量分別是陳皮的20倍和23倍，橘皮素量是陳皮的14倍和15倍。藥理作用顯示多甲氧基黃酮抗癌活性較強(qiáng)［6-7］，其中川陳皮素可通過下調(diào)COX-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減弱細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8-9］;可抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［10-11］及p53突變的人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［12］;體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明川陳皮素有抗肺癌細(xì)胞增殖活性［13］。橘皮素可將人乳腺癌細(xì)胞周期阻斷在G1期而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［14］，并可抑制黑色素瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［15］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于解釋青皮可用于治療氣血瘀滯之癥瘕，而陳皮無此功效有一定啟示。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 不同產(chǎn)地青皮、陳皮中4種黃酮的量Tab.2 Determination of flavonoids in Citri reticulatae Pericarpium and Citri reticulatae Pericarpium viride collected from different growing areas

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)浙江、湖北產(chǎn)青皮、陳皮中橙皮苷的量符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，而廣東產(chǎn)廣陳皮、青皮中橙皮苷量達(dá)不到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。本課題組曾收集多批新會(huì)產(chǎn)廣陳皮樣品，測(cè)定發(fā)現(xiàn)廣陳皮中橙皮苷的量均較低，多批次均達(dá)不到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。但來源于茶枝柑的廣陳皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量要遠(yuǎn)高于來源于橘的陳皮，分別是其11倍和8倍，此種含有量上的差異能否引起陳皮與廣陳皮功效的不同有待于進(jìn)一步研究。

3.3 在流動(dòng)相的選擇中，比較了甲醇-水、乙腈-水及在流動(dòng)相中添加不同質(zhì)量的酸對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果顯示在流動(dòng)相中添加酸，可使樣品峰形更對(duì)稱;乙腈-酸水系統(tǒng)對(duì)川陳皮素和橘皮素的分離度比甲醇－酸水系統(tǒng)好。最終確定流動(dòng)相體系為乙腈-0.5%醋酸水體系，4種成分可以達(dá)到基線分離。

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