喬艷明，陳文強(qiáng)*，2，鄧百萬，2，彭浩，2，解修超，2，張輝，潘嘉偉

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000；3.陜西省南鄭中學(xué)，陜西南鄭723100）

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖工藝

喬艷明1，陳文強(qiáng)*1，2，鄧百萬1，2，彭浩1，2，解修超1，2，張輝3，潘嘉偉3

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000；3.陜西省南鄭中學(xué)，陜西南鄭723100）

為了優(yōu)化豬苓多糖的微波提取工藝，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，研究液料比、pH、微波功率、提取時(shí)間、提取次數(shù)及其交互作用對(duì)多糖提取率的影響。應(yīng)用Design Expert和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，模擬得到回歸方程的預(yù)測(cè)模型和可信度，分析得到最佳提取工藝條件為：液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取時(shí)間2.5 min，提取次數(shù)2次。在此條件下，多糖提取率達(dá)到6.75%。利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到的豬苓多糖提取條件參數(shù)，為豬苓多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

豬苓；微波輔助提取；多糖；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)面分析

豬苓（Polyporus umbellatus），俗稱豬屎苓、野豬糞等。屬真菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、豬苓（地花）屬。豬苓主要分布于河北、陜西、四川等地［1］，其菌核含麥角甾醇、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖分、多糖及X-羥基二十四碳酸等成分［2-3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，豬苓提取物中多糖成分具有抗氧化［4］、增強(qiáng)免疫功能［5］和保護(hù)肝臟［6］等作用，臨床應(yīng)用也取得了較好療效。

近年來，真菌多糖的提取技術(shù)已由傳統(tǒng)的溶劑提取法逐漸轉(zhuǎn)向運(yùn)用超聲波［7-8］和微波輔助提取［9-10］新技術(shù)。與傳統(tǒng)方法相比，微波輔助提取真菌多糖具有速度快、選擇性高、提取率高、溶劑消耗少、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)［11-13］，同時(shí)可以防止提取物在長(zhǎng)時(shí)間、高溫條件下發(fā)生降解和褪色。響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是可通過回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題，具有周期短、精度高、實(shí)用價(jià)值高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、生物學(xué)、食品學(xué)、工程學(xué)等領(lǐng)域，在真菌多糖微波輔助提取條件優(yōu)化研究中也取得了良好效果［14］。2011年，曾維才［15］等采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取黑木耳多糖工藝，黑木耳多糖提取率可達(dá)16.53%；2012年，Zhao［16］等用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助提取梭柄松苞菇多糖，梭柄松苞菇多糖提取率為（7.83±0.19）%；2012年，Chen［17］等用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取銀耳多糖，銀耳多糖提取率為（65.07±0.99）%；2013年，楊開［18］等用響應(yīng)面法優(yōu)化了微波輔助提取松木層孔菌多糖，松木層孔菌多糖提取率為3.88%；2014年，岳春［19］等用響應(yīng)面法優(yōu)化了微波輔助提取蟲草多糖，蟲草多糖提取率為12.1%。

目前，響應(yīng)面法用于優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖的工藝尚未見研究報(bào)道，本研究中采用微波輔助提取豬苓多糖，并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，借助Design Expert軟件，采用Box-Behnken模式對(duì)各主要影響因素之間的單一和交互作用等進(jìn)行了研究，得出最佳提取工藝參數(shù)，為從豬苓菌核中提取多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料豬苓菌核由陜西天美綠色產(chǎn)業(yè)有限公司提供。

1.1.2主要試劑無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、氯仿等均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水。

1.1.3主要儀器723N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；FW177型高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠制造；101A-1型鼓風(fēng)干燥箱，上海試驗(yàn)儀器總廠制造；RV10基本型V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科試驗(yàn)室技術(shù)有限公司制造；WD700型微波爐，樂金電子電器有限公司制造；WF-2000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)，上海屹堯分析儀器有限公司制造；BSA8201型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司制造；PHS-3C型精密酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司制造。

1.2方法

1.2.1材料預(yù)處理將新鮮豬苓菌核除雜，60℃烘干至恒質(zhì)量，24 000 r/min粉碎1 min，40目過篩，備用。

1.2.2微波提取方法精確稱取豬苓粉末5.0 g，按照一定的液料比加入純化水，調(diào)節(jié)pH，在一定的微波功率下提取一定時(shí)間，抽濾，按照此法提取若干次，合并濾液真空濃縮，室溫下定容至200 mL。

1.2.3多糖的測(cè)定方法苯酚-硫酸法［20］。

1.2.4單因素試驗(yàn)按照1.2.2提取步驟，研究提取次數(shù)、液料比、pH、微波功率、提取時(shí)間5個(gè)因素對(duì)豬苓多糖提取率的影響。

1）提取次數(shù)試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，分別選擇不同提取次數(shù)，其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2）液料比試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，分別選擇不同液料比，其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

3）pH試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，分別選擇不同pH，其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

4）微波功率試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，分別選擇不同微波功率，其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

5）提取時(shí)間試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，分別選擇不同提取時(shí)間，其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5微波提取最佳工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取液料比（X1）、pH（X2）、微波功率（X3）、提取時(shí)間（X4）、提取次數(shù)（X5）為考察對(duì)象，以豬苓多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，采用5因素3水平響應(yīng)面分析法確定最佳提取工藝條件。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1　5因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　Experiment design of 5 factors and 3 levels

2　結(jié)果與分析

2.1微波輔助提取豬苓多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，在液料比25∶1（mL/g）、pH 6.5、微波功率420 W、提取時(shí)間3 min的條件下，研究不同提取次數(shù)（1，2，3，4次）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.1　Effect of extraction number on extraction rate of polysaccharide

圖1結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率也逐漸增大。當(dāng)提取2次時(shí)，提取率為5.06%。當(dāng)提取次數(shù)大于2次時(shí)，多糖提取率增加緩慢，基本趨于穩(wěn)定。增加提取次數(shù)，會(huì)增加提取成本，同時(shí)會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)。綜合考慮提取效果和經(jīng)濟(jì)節(jié)約等因素，因此，選擇微波提取豬苓多糖的提取次數(shù)為2次。

2.1.2液料比對(duì)多糖提取率的影響準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，在pH 6.5、微波功率420 W、提取時(shí)間3 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同液料比15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1（mL/g）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2　Effect of the ratio of liquid to solid on extraction rate of polysaccharide

圖2結(jié)果表明，豬苓多糖提取率隨著液料比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在液料比為30∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大，提取率為5.08%。因此，選擇微波提取豬苓多糖的液料比為30∶1（mL/g）。

2.1.3pH對(duì)多糖提取率的影響準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、微波功率420 W、提取時(shí)間3 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　pH對(duì)多糖提取率的影響Fig.3　Effect of pH on extraction rate of polysaccharide

圖3結(jié)果表明，多糖提取率在pH為6.5時(shí)達(dá)到最大，提取率為5.81%，增大或減小pH均會(huì)導(dǎo)致多糖提取率降低。因此，選擇微波提取豬苓多糖的pH為6.5。

2.1.4微波功率對(duì)多糖提取率的影響準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、pH 6.5、提取時(shí)間3 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同微波功率（140，280，420，560，700 W）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　微波功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.4　Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharide

圖4結(jié)果表明，多糖提取率隨著微波功率的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在微波功率為560 W時(shí)達(dá)到最大，提取率為6.39%。因此，選擇微波提取豬苓多糖的微波功率為560 W。

2.1.5提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響準(zhǔn)確稱取豬苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、pH 6.5、微波功率560 W、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 min）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.5　Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

圖5結(jié)果表明，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為2 min時(shí)達(dá)到最大，提取率為6.48%。因此，選擇微波提取豬苓多糖的提取時(shí)間為2 min。

2.2Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化主要影響因素水平

采用5因素3水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行研究，考慮各因素間的交互作用以及各因素對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Box-Behnken design and experimental result

續(xù)表2

經(jīng)Design Expert軟件對(duì)46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的多糖提取率進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析，得出二次模型回歸統(tǒng)計(jì)分析表（表3）。

多糖提取率的回歸方程如下：

表3　回歸分析結(jié)果Table 3　Result of regression analysis

表3結(jié)果表明，X2、X2X4、X3X4、X3X54項(xiàng)顯著；X1、X3、X4、X5、X2X3、X12、X22、X32、X42、X5210項(xiàng)極顯著，其他X1X2、X1X3、X1X4、X1X5、X2X5、X4X5不顯著。模型P值小于0.000 1，可信度水平大于99.99%，說明該模型有意義?；貧w模型的R2=0.983 4，R2Adj=0.970 2，說明多糖提取率的試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度。該模型失擬項(xiàng)P值為0.610 3＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明試驗(yàn)操作可信，試驗(yàn)理論可使用。另外從F值可看出單因素對(duì)多糖提取率的影響順序：X4＞X5＞X3＞X1＞X2，即影響順序依次為：提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞微波功率＞液料比＞pH。

2.3響應(yīng)面及最佳優(yōu)化條件的驗(yàn)證

根據(jù)回歸方程繪制多糖提取率隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖。由響應(yīng)曲面圖可知，液料比、pH、微波功率、提取時(shí)間、提取次數(shù)5個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響（圖6—15）。每個(gè)響應(yīng)曲面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立因素間的相互作用，其余兩個(gè)因素保持在編碼水平的0水平。

由圖6—9可知，液料比與其它各因素之間的交互作用對(duì)多糖提取率的影響均不顯著。

圖6　Y=f（X1，X2）響應(yīng)曲面Fig.6　Response surface of Y=f（X1，X2）

圖7　Y=f（X1，X3）響應(yīng)曲面Fig.7　Response surface of Y=f（X1，X3）

圖8　Y=f（X1，X4）響應(yīng)曲面Fig.8　Response surface of Y=f（X1，X4）

圖9　Y=f（X1，X5）響應(yīng)曲面Fig.9　Response surface of Y=f（X1，X5）

由圖10可知，微波功率和pH的交互作用十分顯著；在低微波功率條件下隨著pH的增大，多糖提取率會(huì)逐漸升高，最后趨于平穩(wěn)；而在高微波功率條件下，隨著pH的增大，多糖提取率會(huì)先緩慢升高然后迅速下降。

圖10　Y=f（X2，X3）響應(yīng)曲面Fig.10　Response surface of Y=f（X2，X3）

由圖11可知，pH和提取時(shí)間的交互作用顯著；在一定pH條件下，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率會(huì)迅速升高至平穩(wěn)，然后略有下降。

圖11　Y=f（X2，X4）響應(yīng)曲面Fig.11　Response surface of Y=f（X2，X4）

由圖12可知，提取次數(shù)和pH的交互作用不顯著。

圖12　Y=f（X2，X5）響應(yīng)曲面Fig.12　Response surface of Y=f（X2，X5）

由圖13可知，微波功率和提取時(shí)間的交互作用顯著；在低微波功率條件下，多糖提取率會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，先升高至平穩(wěn)，后略有下降；在高微波功率條件下，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，起初升高較快，后來比較緩慢，逐漸趨于平穩(wěn)。

圖13　Y=f（X3，X4）響應(yīng)曲面Fig.13　Response surface of Y=f（X3，X4）

由圖14可知，微波功率和提取次數(shù)的交互作用顯著；在一定的微波功率條件下，隨著提取次數(shù)增加和微波功率的增大，多糖提取率都是起始升高較快，最后趨于平穩(wěn)。

圖14　Y=f（X3，X5）響應(yīng)曲面Fig.14　Response surface of Y=f（X3，X5）

由圖15可知，提取時(shí)間和提取次數(shù)的交互作用不顯著；按照一定的提取次數(shù)，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率起始升高較快，最后趨于平穩(wěn)。

圖15　Y=f（X4，X5）響應(yīng)曲面Fig.15　Response surface of Y=f（X4，X5）

綜上所述，由回歸模型得到影響豬苓多糖提取率的各因素最優(yōu)值為液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取時(shí)間2.5 min，提取次數(shù)2次，此時(shí)豬苓多糖提取率的最大預(yù)測(cè)值為6.68%。為了檢驗(yàn)該最佳提取工藝的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖提取率的驗(yàn)證值為6.75%。由于多糖提取率的驗(yàn)證值與最大估計(jì)預(yù)測(cè)值非常接近，因此，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖的工藝是有效可行的。

3　結(jié)語

通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)得到微波輔助提取豬苓多糖的最佳工藝條件為：液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取時(shí)間2.5 min，提取次數(shù)2次。在此工藝條件下，獲得豬苓多糖的提取率為6.75%。

近年來，利用微波輔助提取豬苓多糖的研究報(bào)道甚少。2012年，李志洲［21］用二次回歸正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖工藝，提取率僅2.86%；2012年，孫纓［22］等用正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖工藝，提取率為3.663%。

與李、孫的研究相比，本研究中采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取豬苓多糖的工藝，其提取率顯著高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。一方面由于多糖檢測(cè)方法（苯酚-硫酸法）的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較好［23］；另一方面是基于響應(yīng)面法可在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合，預(yù)測(cè)響應(yīng)值，比其他分析方法更為高效［14］。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到的豬苓多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可為豬苓多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的技術(shù)支持。

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Microwave-Assisted Extraction of Polysaccharides from Polyporus umbellatus Optimized by Box-Behnken Design-Response Surface Methodology

QIAO Yanming1，CHEN Wenqiang1，2，DENG Baiwan1，2，PENG Hao1，2，XIE Xiuchao1，2，ZHANG Hui3，PAN Jiawei3
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723000，China；3.Nanzheng Middle School of Shaanxi，Nanzheng 723100，China）

To optimize the microwave-assisted extraction technique of polysaccharide from Polyporus umbellatus，the effects of the liquid to solid ratio，pH，microwave power，extraction time，extraction number and their interaction on extaction were studied by Box-Behnken design.The predictive model and reliability were developed by Design Expert software and response surface analysis（RSM）.The optimal extraction conditions were achieved and listed as follows：liquid-to-solid ratio 30∶1 mL/g，pH 6.6，microwave power 614 W，extraction time 2.5 mins，extraction number 3 times.Under these conditions，the extraction yield of polysaccharide was up to 6.75%.The extraction conditions achieved by RSM provided technical support for the industrialproduction of polysaccharide from Polyporus umbellatus.

Polyporusumbellatus，microwave-assisted extraction，polysaccharides，Box-Behnken design，response surface analysis

Q 949.329.7

A

1673—1689（2015）09—0986—09

2014-10-07

陜西省“春筍計(jì)劃”研究項(xiàng)目（2014-2015）。

陳文強(qiáng)（1956—），男，陜西洋縣人，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物資源的保護(hù)與利用研究。E-mail：wenqiangc@126.com