高翠翠，唐雪，2，藺憶，陳立立，施用暉，2，樂國偉*，2

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

硫辛酸對高糖誘導(dǎo)小鼠RIN-m5F細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制

高翠翠1，唐雪1，2，藺憶1，陳立立1，施用暉1，2，樂國偉*1，2

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

探究α-硫辛酸（α-LA）對高糖誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。RIN-m5F細(xì)胞分為對照組（11 mmol/L葡萄糖）、葡萄糖損傷組（22 mmol/L或44 mmol/L葡萄糖）、α-LA干預(yù)組（上述3個葡萄糖濃度+200 μmol/L α-LA），分別檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）水平、總抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）活性；BAX、BCL-2、GSK-3β mRNA表達(dá)水平；細(xì)胞線粒體膜電位及蛋白印跡法檢測GSK-3β和p-Ser9 GSK-3β蛋白質(zhì)水平。結(jié)果表明，與糖損傷組相比，200 μmmol/L α-LA顯著降低胞內(nèi)ROS水平，分別降低30%和83%；增強(qiáng)細(xì)胞SOD活性及T-AOC能力，降低MDA積累；上調(diào)抗凋亡因子BCL-2 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白質(zhì)BAX mRNA表達(dá)水平，提高細(xì)胞線粒體膜電位。此外，α-LA能夠下調(diào)GSK-3β mRNA表達(dá)水平，提高p-Ser9 GSK-3β蛋白質(zhì)水平，表明α-LA對高糖誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞的抗氧化和抗凋亡保護(hù)作用與調(diào)節(jié)GSK-3β有關(guān)。

硫辛酸；葡萄糖；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

高血糖導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，高濃度葡萄糖環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而造成細(xì)胞各項(xiàng)功能受損，而胰島β細(xì)胞抗氧化酶（如CAT、GPx、SOD）活性相對較低，更易受到氧化損傷而引發(fā)糖尿?。?］。

α-硫辛酸（α-LA）在糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防及治療中已經(jīng)有所應(yīng)用。α-LA與其還原形式二氫硫辛酸（DALA）均具有較強(qiáng)抗氧化作用，可通過直接清除氧自由基、螯合金屬離子如銅和鐵、再生內(nèi)源性抗氧化劑和修復(fù)氧化損傷等途徑減輕機(jī)體氧化應(yīng)激［2-4］。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)α-LA對細(xì)胞的保護(hù)作用，例如它可以抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［5］，抑制TNF-a誘導(dǎo)的肝細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡［6-7］；也有研究表明α-LA能夠減少自由基對胰島β細(xì)胞的損害，對抗凋亡。但是α-LA保護(hù)胰島β細(xì)胞的具體機(jī)制尚未明確［8-9］。

GSK-3β在多種信號傳導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，它不僅通過激活糖原合成酶調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝及能量代謝過程，而且在細(xì)胞生長、分化、突變和凋亡等生命活動中也具有重要的調(diào)控作用［10］。研究顯示，GSK-3β是胰島細(xì)胞增殖分化的限速酶。正常小鼠敲除GSK-3β可提高胰島β細(xì)胞功能，飼喂高脂日糧后仍具有正常的葡萄糖耐受能力及胰島功能［11］。姜黃素可以通過增加GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制GSK-3β活性，對抗Aβ導(dǎo)致的線粒體代謝缺陷和氧化應(yīng)激［12］。此外，LA可通過增加p-GSK-3β水平保護(hù)活性氮介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［13］，抑制GSK-3β表達(dá)，對抗BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)［14］。

目前，α-LA對胰腺β細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用是否與GSK-3β有關(guān)，尚未有報道。因此，本研究以胰島素瘤細(xì)胞株（RIN-m5F）為對象，探究α-LA可能的抗氧化機(jī)制，以期為I型糖尿病的防治提供有價值的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

小鼠胰島素瘤細(xì)胞系RIN-m5F，江南大學(xué)藥學(xué)院金堅教授饋贈。RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清，GIBCO公司產(chǎn)品；α-LA（純度99%），江蘇富士萊醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品；DCFH-DA熒光探針試劑盒，JC-1線粒體膜電位測定試劑盒，碧云天生物公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所研制；Trizol，熒光染料SBY，美國Biomiga公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司產(chǎn)品；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；兔抗鼠GSK-3β抗體，p-Tyr216GSK-3β抗體，p-Ser9GSK-3β抗體，美國Cell Sinaling公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Spectra Max M5/M5e酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司制造；7900HT Fast Real-Time PCR儀，美國ABI公司制造；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司制造；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple公司制造。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

RIN-m5F培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃和體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合時，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2體積比傳代培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

細(xì)胞貼壁長至50%體積時，分別轉(zhuǎn)入不同條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)分組：對照組（11mmol/L葡萄糖）；糖損傷組（22 mmol/L葡萄糖，44 mmol/L葡萄糖）；α-LA干預(yù)組（11 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，22 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，44 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA）。

1.4活性氧自由基（ROS）測定

細(xì)胞接種于96孔板，分組及處理同上。去除培養(yǎng)液，加入稀釋好的DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。M5熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，分組及處理同上。預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L PBS）清洗細(xì)胞2次，RPMI細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存待測。

嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定細(xì)胞裂解液中相關(guān)指標(biāo)：MDA、SOD、T-AOC。

1.6細(xì)胞線粒體膜電位測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，分組及處理同上。嚴(yán)格按照J(rèn)C-1線粒體膜電位試劑盒說明書測定，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7Real-Time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取2.0 μg總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA（20 μL反應(yīng)體系），-20℃保存。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃20 s，退火62℃30 s，延伸72℃20 s，所有基因均為40個循環(huán)；終末延伸72℃2 min?；蛞锷舷掠涡蛄屑巴嘶饻囟纫姳?。

表1　引物序列及退火溫度Table 1　Sequences of the primers and annealing temperature

1.8Western-blot檢測GSK-3β蛋白質(zhì)水平

各組細(xì)胞抽提蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各組樣品按40 μg/孔點(diǎn)樣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5% SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)至PVDF膜。體積分?jǐn)?shù)5%BSA TBST液在室溫條件下封閉60 min。GSK-3β抗體（體積比1∶1 000）、p-Ser9GSK-3β抗體（體積比1∶1 000），4℃孵育過夜。洗滌后二抗室溫孵育60 min。顯色，成像，電泳圖像分析系統(tǒng)分析。

1.9數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

采用SPASS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，并作Duncan多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±SD表示，顯著水平為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1α-LA對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

隨著葡萄糖濃度的增加，細(xì)胞ROS水平逐漸升高，且差異顯著（P＜0.05）；添加200 umol/L α-LA可顯著降低22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組ROS水平（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖組可恢復(fù)至正常水平。如圖1所示。

圖1　各組細(xì)胞存活率及ROS水平的影響Fig.1　Influence of α-LA on ROS and the viability of RIN-m5F treated with glucose

2.2細(xì)胞SOD活性、MDA水平以及T-AOC的變化

隨著葡萄糖濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、T-AOC顯著降低（P＜0.05）；而α-LA干預(yù)可顯著提高各組SOD活性（P＜0.05），22 mmol/L葡萄糖+α-LA組可恢復(fù)至正常水平；此外，添加α-LA后可提高22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組T-AOC水平，降低MDA含量（P＜0.05），表明LA可有效降低高糖引起的氧化應(yīng)激，見表2。

2.3細(xì)胞BAX和BCL-2 mRNA表達(dá)水平的變化

隨著葡萄糖濃度的增加，BAX mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），BCL-2 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；添加α-LA后可在一定程度恢復(fù)22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖組BCL-2表達(dá)水平，降低BAX表達(dá)水平（P＜0.05），表明LA具有一定的抗凋亡作用，如圖2所示。

表2　各組細(xì)胞MDA、SOD和T-AOC水平的比較Table 2　Effects ofα-LA on MDA content，SOD activities and T-AOC in RIN-m5F treated with glucose

圖2　各組細(xì)胞BAX-2mRNA表達(dá)的變化Fig.2　Expression of BAX-2 gene in different groups

2.4線粒體膜電位變化

隨著葡萄糖濃度的增加，線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05）；α-LA干預(yù)后，各組相比損傷組線粒體膜電位均有顯著升高（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖+α-LA組可恢復(fù)至正常水平，如圖3、4所示。

2.5α-LA干預(yù)對GSK-3β mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響

α-LA對各組細(xì)胞GSK-3β基因水平的影響如圖5所示，GSK-3β mRNA表達(dá)水平隨葡萄糖濃度增加而提高（P＜0.05）；α-LA干預(yù)可顯著降低糖損傷組GSK-3β mRNA表達(dá)水平，其中22 mmol/L葡萄糖組可下調(diào)至正常水平。

Western-blot檢測細(xì)胞GSK-3β磷酸化水平，結(jié)果如圖6和圖7所示，隨著葡萄糖濃度的升高，GSK-3β Ser9位點(diǎn)磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；α-LA干預(yù)后，相比損傷組Ser9位點(diǎn)磷酸化水平均有顯著升高（P＜0.05）。

3　討論

Brownlee的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為，在高糖環(huán)境，線粒體呼吸鏈生成過多氧自由基可激活晚期糖基化終末產(chǎn)物途徑、多元醇途徑，以及蛋白激酶C途徑，后者反過來又能促進(jìn)自由基的生成，形成惡性循環(huán)［15］。

圖3　α-LA對RIN-m5F細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.3　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

圖4　α-LA對RIN-m5F細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

圖5　各組細(xì)胞GSK-3β mRNA表達(dá)的變化Fig.5　Expression of GSK-3β gene in different groups

圖6　western-blot檢測各組細(xì)胞p-GSK-3β蛋白水平表達(dá)Fig.6　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

圖7　western-blot檢測各組細(xì)胞p-GSK-3β蛋白表達(dá)灰度值Fig.7　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

胰島β細(xì)胞功能紊亂是糖尿病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，由于β細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)處于較低水平，使其更易發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及胰島素分泌功能降低［16］。正常生理狀況下，胞內(nèi)ROS生成和清除處于動態(tài)平衡，ROS過多生成引起細(xì)胞氧化損傷。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)被活性氧氧化的產(chǎn)物，是評價氧化損傷程度的重要標(biāo)志物，其過度累積可直接反映受氧化應(yīng)激損傷的程度［17］。SOD是細(xì)胞受到外界刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性抗氧化酶類，可以清除活性氧物質(zhì)，對維持氧化與抗氧化平衡起著重要作用，通過檢測SOD活性可間接反映胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平［18］。本研究中以11、22、44 mmol/L葡萄糖分別孵育RIN-m5F細(xì)胞72 h，發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，且與糖濃度呈正相關(guān)。200 μmol/L α-LA干預(yù)可使高糖組細(xì)胞MDA和ROS生成顯著降低，SOD活性及T-AOC水平顯著升高。表明α-LA對RIN-m5F細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，與調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、增強(qiáng)總抗氧化能力有關(guān)。

糖原合成酶激酶GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在生物體內(nèi)參與多種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與激活，以及調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命活動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有廣泛的細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，ROS升高導(dǎo)致GSK-3β Ser9位點(diǎn)磷酸化水平降低，從而激活GSK-3β，造成線粒體內(nèi)Ca2+外流，線粒體膜電位改變，PTP通道打開。激活后的GSK-3β能夠促進(jìn)線粒體促凋亡蛋白質(zhì)BAX表達(dá)［10］。BAX是BCL-2家族的重要蛋白質(zhì)之一，正常條件下BCL-2與BAX形成異源二聚體，抑制BAX的功能。當(dāng)BCL-2減少時，釋放出來的BAX形成同源二聚體，在線粒體外膜形成足夠讓凋亡蛋白質(zhì)傳輸?shù)目椎?，使線粒體膜電位破壞，造成線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。王俐［19］等研究發(fā)現(xiàn)，α-LA可以抑制高糖誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞線粒體膜電位降低，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Yoshiki Koriyama［14］等指出，LA可以通過抑制GSK-3β的表達(dá)對抗BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為神經(jīng)病變性疾病提供依據(jù)。但α-LA能否調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞GSK-3β活性，尚未見相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，高糖可以顯著誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞凋亡，上調(diào)GSK-3β mRNA表達(dá)水平，下調(diào)GSK-3β Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平，激活GSK-3β活性；α-LA干預(yù)后，GSK-3β mRNA水平顯著下調(diào)，GSK-3β Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上調(diào)，并且伴隨Bax mRNA表達(dá)水平下調(diào)及BCL-2 mRNA水平上調(diào)，線粒體膜電位顯著升高，其中200 μmol/L α-LA可使22 mmol/L葡萄糖組各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)至正常水平。表明α-LA可能通過抑制GSK-3β活性調(diào)節(jié)線粒體BCL-2表達(dá)，從而抑制BAX釋放，進(jìn)而提高線粒體膜電位，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，維護(hù)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。

4　結(jié)語

綜上，推測GSK-3β可能是α-LA保護(hù)高糖損傷胰島細(xì)胞的一個重要信號分子，α-LA可能通過提高GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制其活性，從而降低促凋亡蛋白質(zhì)表達(dá)，提高線粒體膜電位，維護(hù)RIN-m5F細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。

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Cytoprotective Effect of α-Lipoic Acid on RIN-m5F Cultured with High Glucose

GAO Cuicui1，TANG Xue1，2，LIN Yi1，CHEN Lili1，SHI Yonghui1，2，LE Guowei*1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The aim of this study is to investigate whether α-lipoic acid（α-LA）prevents high glucose-induced oxidative damage and apoptosis of pancreatic islet beta cells.In the present sudy，RIN-m5F cells were incubated with different concentration of glucose（11 mmol/L，22 mmol/L and 44 mmol/L）in the presence or absence of 200 μmol/L α-LA for 72 h.Then，cellular reactive oxygen species（ROS）levels，malandialdehyde（MDA）levels，total antioxidant capacity（T-AOC）and superoxide dismutase（SOD）activity were assayed with the appropriate test kits；mitochondrial membrane potential was detected by flow cytometry；relative genes levels were analyzed by reverse transcriptase polymerase chain reaction；western blotting was used to determine protein expression of GSK-3β and p-GSK-3β（Ser9）.The results show that α-LA significantly reduced the MDAformation and inhibited the ROS production induced by high glucose，whereas increased T-AOC and SOD activity.Additionally，α-LA induced membrane depolarization and increased mitochondrial membrane potential.These effects were mediated by Bcl-2 associated X protein（BAX）and B-cell lymphoma-2（BCL-2）expression.Western blotting indicated that α-LA inhibited GSK-3β by increasing p-GSK-3β（Ser9）level.Therefore，our data suggest that α-LA can effectively attenuate high glucose-induced RIN-m5F cell oxidative damage and apoptosis，by mechanisms which probably involves the inactivation of GSK-3β by phosphorylation.These findings provide a new interpretation on the role of α-LA in the treatment of diabetes.

α-lipoic acid，glucose，oxidative stress，apoptosis

TS 201.2

A

1673—1689（2015）09—0949—07

2014-06-04

國家“十二五”科技支撐計劃項(xiàng)目（2012BAD33B05）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

樂國偉（1956—），男，浙江寧波人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事營養(yǎng)代謝與調(diào)控研究。E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn