王 磊，劉玉雪，譚海東，劉武軍，趙宗保

（中國科學院 大連化學物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023）

基于海泡石的細胞透性化

王 磊，劉玉雪，譚海東，劉武軍，趙宗保

（中國科學院 大連化學物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023）

利用礦石納米材料海泡石處理大腸桿菌細胞，建立高效、可逆透性化處理方法。結(jié)果表明：海泡石和大腸桿菌BW25113細胞懸液渦旋振蕩，細胞通透性增強，90%以上的細胞因滲入博萊霉素致死；而在4℃修復處理過的樣品，僅23%的細胞被殺死。發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）進出透性化細胞的能力與胞內(nèi)外NAD濃度梯度正相關(guān)。該可逆透性化方法對生物催化和藥物遞送等研究具有重要價值。

細胞透性化；海泡石；博萊霉素；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；礦石納米材料

由于存在細胞壁和細胞膜的天然屏障，生物轉(zhuǎn)化過程中許多物質(zhì)的胞內(nèi)外傳遞都受到跨膜轉(zhuǎn)運效率的限制。細胞透性化是指在不造成細胞裂解的情況下，改變細胞壁和細胞膜通透性，使部分非透性分子能夠自由進出細胞。細胞透性化技術(shù)已廣泛應用于生物技術(shù)及生命科學研究中［1-2］。根據(jù)細胞能否修復，透性化分為可逆透性化及不可逆透性化。由于可逆透性化需要嚴格控制處理條件，通常采用不可逆透性化處理細胞，用于提高酶穩(wěn)定性及生物轉(zhuǎn)化效率［3-4］。然而，當需要保證細胞存活率和保持生物催化劑穩(wěn)定性時，必須采用可逆透性化。電穿孔法是最常用的可逆透性化方法，由于其效率低，通常只在實驗室用于DNA轉(zhuǎn)化及藥物治療［5］。經(jīng)過優(yōu)化的化學法也能實現(xiàn)可逆透性化，用于將量子點、蛋白質(zhì)等納米顆粒或分子輸入細胞［6-7］。例如，采用鏈球菌溶血素O可在腫瘤細胞膜上造成直徑約35 nm的可修復小孔，允許相對分子質(zhì)量達1.00×105的活性蛋白進入細胞，加入Ca2+后約50%的細胞可修復［7］。

海泡石（分子式為H4Mg2Si3O10）是長約5 μm、直徑在 10～50 nm的針狀納米礦石，遠小于Escherichia coli的細胞尺寸［8］。在固體培養(yǎng)基表面涂布海泡石與細胞懸液可使細胞可逆透性化，實現(xiàn)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化［9］，但以涂布方式進行細胞透性化難以達到體系放大的目的。海泡石可在溶液中形成均勻的膠體狀懸濁液［10］。

本文中，筆者嘗試通過振蕩海泡石與細胞的懸濁液使細胞透性化，用博萊霉素敏感性考察透性化的效率及透性化后的細胞存活率［11］，用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）確定細胞膜的修復時間及分子通過透性化細胞膜輸送的特點，以建立了一種基于海泡石的高效、易于放大的細胞可逆透性化方法，對生物催化、藥物遞送研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌E.coli BW25113，美國耶魯大學大腸桿菌遺傳庫存中心（Coli Genetic Stock Center）；海泡石，德國 Kremer Pigmente有限公司；博萊霉素，Invitrogen公司；NAD、溶菌酶、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；乙腈，Merck公司；其他培養(yǎng)基及生化試劑（醋酸銨、NaCl等），大連博諾生物化學試劑廠。

海泡石用磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.5）配成50mg/mL貯液，NAD用去離子水配成0.25 mol/L貯液，博萊霉素用去離子水配成100mg/mL貯液。

LB培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L NaCl，用NaOH調(diào)pH至7.0，固體LB培養(yǎng)基加入15g/L瓊脂粉，在120℃滅菌20min備用。

1.2 透性化E.coli BW25113的制備

從平板挑E.coli BW25113單菌落接種100mL LB于37℃、200r/min搖床，培養(yǎng)至OD600為3.4。2 000g離心6min收集菌體，菌體用PBS洗2遍并懸浮于30mL PBS中使OD600為11。將菌液與0.1體積海泡石貯液在1.5mL離心管中混合，使海泡石終質(zhì)量濃度達到 5mg/mL，用美國 Scientific Industries公司生產(chǎn)的Vortex-Genie 2渦旋振蕩器振蕩處理0.5min，振蕩強度為2 700r/min（最大功率）。

1.3 確定透性化效率及修復效率

取0.9mL的E.coli BW25113與5mg/mL海泡石混合后振蕩0.5min進行透性化處理，立即取90 μL加入10 μL博萊霉素至終質(zhì)量濃度10mg/mL，輕柔混合，剩余的透性化細胞于30℃放置30min使細胞膜修復后，取90 μL加10 μL博萊霉素至質(zhì)量終濃度10mg/mL，輕柔混合。以不進行透性化處理為對照組，將E.coli BW25113和5mg/mL海泡石輕柔混合，于30℃放置30min，再加入10mg/mL博萊霉素輕柔混合。以上3種樣品與博萊霉素混合后于4℃放置30min，使博萊霉素進入細胞，用PBS稀釋105倍，取50 μL涂布LB平板，37℃培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，只有透性化后恢復或未被透性化的細胞可以存活并形成菌落。每種樣品的實驗設(shè)3個平行樣，實驗數(shù)據(jù)為3個平行樣的平均值。

1.4 確定透性化細胞膜的修復時間

通過檢測NAD轉(zhuǎn)運效率隨修復時間的變化，確定透性化處理后細胞膜修復時間。取0.8mL的E.coli BW25113（OD600為11）與5mg/mL海泡石振蕩0.5min進行透性化處理，于30℃靜置使細胞膜修復0、10、20和30min。隨后分別加入2 mmol/L的NAD輕柔混勻，以避免后續(xù)操作中由細胞透性產(chǎn)生的NAD滲漏，并于30℃靜置30min使細胞膜充分修復。靜置后立即洗滌菌體并浸提胞內(nèi)NAD。

參照文獻［12］的方法浸提檢測胞內(nèi) NAD。2 000g離心6min收集菌體，用0.9mL PBS洗2遍加0.8mL的1mg/mL溶菌酶，重懸，加入0.4mL氯仿振蕩1min使細胞充分裂解，16 000g離心10min，取0.7mL上層水相凍干，檢測時用0.2mL醋酸銨溶解。

使用美國Dionex公司的高壓液相色譜（HPLC）檢測NAD濃度。色譜條件：SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6mm×200mm，5 μm）；流動相為 50 mmol/L醋酸銨（A）-乙腈（B）溶液（兩者體積比為95∶5），等度洗脫；UVD170U紫外檢測器，檢測波長260 nm。

1.5 NAD輸送速率與濃度梯度的關(guān)系

在E.coli BW25113懸液中加入NAD至1、2、2.5和3 mmol/L混勻，取0.8mL與5mg/mL海泡石輕柔混合，混合后振蕩0.5min進行透性化處理，對照組與海泡石輕柔混合后不進行振蕩處理。透性化處理樣品及對照組于30℃靜置20min后立即洗滌菌體并浸提檢測胞內(nèi)NAD，檢測方法同上。透性化處理樣品及對照組的差值為通過透性化的細胞膜進入或滲出細胞的NAD量。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli BW25113可逆透性化效率

由于透性化處理后，博萊霉素進入細胞而殺死細胞，可根據(jù)透性化細胞在博萊霉素存在下的存活率確定透性化效率及其中可逆透性化比率。實驗發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)透性化處理的E.coli BW25113樣品在博萊霉素存在下孵育30min后，細胞存活為每毫升（9.0±2.3）× 106個，而經(jīng)透性化處理后僅為每毫升（7.0±0.6）× 105個，即透性化處理使92%的細胞受到損傷，博萊霉素進入細胞達到了致死劑量。然而，當透性化細胞在4℃靜置30min，再用相同劑量博萊霉素混合處理，細胞存活回復到每毫升（7.6±1.8）×106個，這表明77%的透性化細胞可自動修復。這是因為海泡石主要通過物理作用損傷細胞膜，并且相互作用是瞬時的，不會持續(xù)破壞細胞膜的同一位置，有利于細胞自我修復。其他細胞透性化處理方法，包括表面活性劑及有機溶劑處理［4］和鏈球菌溶血素O處理［7］，透性化效率或可逆性低于本方法。

2.2 透性化細胞膜的修復時間

由于NAD不能自由透過完整的細胞膜，但細胞膜受損后NAD就可能跨細胞膜流動，所以可通過檢測NAD轉(zhuǎn)運效率隨修復時間的變化規(guī)律確定透性化處理后細胞膜修復時間。將E.coli BW25113細胞與海泡石懸濁液透性化處理，于30℃靜置，考察NAD滲出細胞的情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知：0～20min，胞內(nèi)NAD的量由8.3 μmol/g（以細胞干質(zhì)量計）降到7.9 μmol/g。修復 20min后，胞內(nèi)NAD的量維持穩(wěn)定。結(jié)果表明，用海泡石透性化處理的E.coli BW25113細胞在30℃下20min內(nèi)自動修復。

圖1 透性化細胞膜的修復時間Fig.1 Resealing course of permeabilized cell membrane

2.3 NAD轉(zhuǎn)運與濃度梯度的關(guān)系

將透性化 E.coli BW25113細胞在不同胞外NAD含量存在下孵育，進一步考察胞內(nèi)NAD含量變化規(guī)律，結(jié)果見圖2。由圖2可知：當胞外NAD含量為較低時，胞內(nèi)NAD傾向于擴散到胞外；而當胞外NAD含量為較高時，胞外NAD擴散進入到胞內(nèi)。說明透性化處理后NAD依賴于濃度梯度跨細胞膜運動。

圖2 依賴于濃度梯度的NAD透膜現(xiàn)象Fig.2 NAD permeation dependent on concentration gradient

3 結(jié)論

基于海泡石的大腸桿菌透性化處理方法具有高效、可逆、操作簡單、易放大的特點。由于海泡石通過物理作用損傷細胞膜，沒有種屬選擇性，預計該方法也可適用于其他微生物細胞。這種透性化處理方法將可應用于生物催化、藥物遞送等研究中。

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（責任編輯 荀志金）

Sepiolite-mediated cell permeabilization

WANG Lei，LIU Yuxue，TAN Haidong，LIU Wujun，ZHAO Zongbao
（Division of Biotechnology，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China）

An efficient，reversible cell permeabilization method was developed by treatment of cells with sepiolite nanofibers.When the suspension of sepiolite nanofibers and Escherichia coli BW25113 cells were votexed，90%of the cells were found susceptible to bleomycin，whereas only 23%of the cells were susceptible upon proper resealing at 4℃.Nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）was either released or taken up by permeabilized cells，and the direction and rate of NAD diffusion were positively correlated to the concentration gradients across the cell membrane.This cell permeabilization method should be useful for biocatalysis and drug delivery.

cell permeabilization；sepiolite；bleomycin；nicotinamide adenosine dinucleotide（NAD）；mineral nanofiber

Q819

A

1672-3678（2015）02-0057-03

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.011

2014-03-11

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2012CB721103）

王 磊（1982—），男，山東濟寧人，博士研究生，研究方向：生物化工；趙宗保（聯(lián)系人），研究員，E-mail：zhaozb@dicp.ac.cn