耿瑜， 蔣明星， 熊正紅， 文孟良*

( 1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 2.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 云南 昆明 650214 )

0 引言

三七人參皂苷是三七的主要藥效成分之一，包括Rb1、Rb2、Rg1、R1等常量人參皂苷組分[1-2].研究表明，常量人參皂苷在人體內(nèi)代謝后，其產(chǎn)生的稀有人參皂苷在抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及提高免疫方面具有顯著的療效[3-7].目前，稀有人參皂苷Rh1主要是通過合成和轉(zhuǎn)化的方法來獲取[8]，其中微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)體系穩(wěn)定、菌種生長迅速、轉(zhuǎn)化周期短且無需分離純化酶液等優(yōu)點，受到眾多研究者的青睞[9].目前，我國利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)稀有人參皂苷的研究仍處于初期階段[3]，相關(guān)研究多集中于把分離純化得到的單一常量人參皂苷轉(zhuǎn)化為另一種稀有人參皂苷.例如,利用Mucilaginibacter sp.(鞘氨醇單胞菌)和Microbacterium esteraromaticum(酯香微桿菌)的β -glucosidase重組酶將Re、Rg1轉(zhuǎn)化為Rg2和Rh1[10-11]；利用Aspergillus niger(黑曲霉菌)中的β -glucosidase將Rf轉(zhuǎn)化為Rh1[12].本文以三七的三醇組常量人參皂苷(含Re、Rg1、R1)為底物，以透性化處理的黑曲霉細(xì)胞為轉(zhuǎn)化菌株，以此探索獲取稀有人參皂苷Rh1的微生物轉(zhuǎn)化法.

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑和培養(yǎng)基

黑曲霉菌，由實驗室分離并保存.Span-20，生工生物工程上海股份有限公司；四氯化碳、吐溫-60、吐溫- 80，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；EDTA，BioFRoxx；戊二醛，天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；乙醇，廣東光華科技股份有限公司；液氮，普諾斯商貿(mào)有限公司；三醇組人參皂苷(含Re、Rg1、R1，其中Rg1含量大于50%，Re和R1含量小于10%)，云南西草生物科技有限公司；Rh1標(biāo)樣，云南與諾生物工程有限責(zé)任公司；硅膠板，青島海洋化工廠分廠.PDB黑曲霉菌絲體培養(yǎng)基(1 L)：20 g葡萄糖，200 g馬鈴薯，自然pH.PDA黑曲霉孢子培養(yǎng)基(1 L)： 20 g葡萄糖，20 g瓊脂，200 g馬鈴薯，自然pH.液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 L)： 1 g酵母粉，1 g胰蛋白胨，2 g三醇組人參皂苷(Rg1含量大于50%、Re和R1含量小于10%)，自然pH.

1.2 儀器

電子天平，Denver Instrument TP-214；恒溫培養(yǎng)振蕩器，Eppendorf Thermonixer；恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器儀表公司；離心機，Eppendorf Centrifuge 5418；超聲破碎儀，Kudos Ultrasonic；搖床，Shiping Rocking Incubator；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA OSB -2100；高效液相色譜儀，Agilent 1100.

1.3 實驗方法

1.3.1種子液的制備與誘導(dǎo)培養(yǎng) 在三角瓶(250 mL)中加入50 mL PDB培養(yǎng)基，接種黑曲霉孢子，在28 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d，制得黑曲霉菌絲體，作為種子液待用.在三角瓶(250 mL)中加入50 mL液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種10%的種子液，在30 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d后，轉(zhuǎn)至室溫靜置培養(yǎng)7 d直至在培養(yǎng)基中能夠檢測到有稀有人參皂苷Rh1產(chǎn)生.

1.3.2透性化細(xì)胞的制備 1)化學(xué)法.將濕重1 g 的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,然后加入表1中的透性化試劑1 mL.在28 ℃、50 r·min-1條件下振蕩處理30 min，離心5 min (12 000 r·min-1)，以去除透性化試劑.用0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉，pH=8.0)洗滌沉淀細(xì)胞，離心5 min (12 000 r·min-1)，最終收集的菌體即為通透性細(xì)胞.

2)物理法.凍融處理：將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中，使用凍融(液氮速凍、45 ℃水浴溶解)的方法處理細(xì)胞，離心5 min (12 000 r·min-1)后收集得到的菌體即為通透性細(xì)胞.超聲處理：用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉，pH=8.0)洗滌誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，離心5 min (12 000 r·min-1)后將沉淀超聲處理(53 kHz) 15 min即得通透性細(xì)胞.

表1 不同方法選用的試劑及其用量

3)聯(lián)合法.將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中，分別使用凍融(液氮速凍+45 ℃水浴溶解)+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法處理細(xì)胞，然后離心5 min (12 000 r·min-1)去除透性化試劑.用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉，pH=8.0)洗滌細(xì)胞后再離心5 min (12 000 r·min-1)即得通透性細(xì)胞.

1.3.3產(chǎn)物檢測 將上述方法得到的透性化細(xì)胞與1 mL 0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組皂苷溶液水浴反應(yīng)30 min (45 ℃).用等體積正丁醇萃取溶液，然后取正丁醇層溶液進行薄層層析，展開劑為氯仿-甲醇(體積比為85∶15)，顯色劑為甲醇-硫酸-乙酸(體積比為85∶5∶10).蒸干每組實驗產(chǎn)量最高的正丁醇層(0.9 mL)，將得到的粉末狀樣品溶于5 mL甲醇中，過濾后取10 μL進行高效液相色譜(HPLC)檢測.色譜柱為Lichrospher C18色譜柱，柱溫為30 ℃，紫外檢測波長為203 nm，進樣量為10 μL，流動相為水(A)和乙腈(B).流動相洗脫梯度： 0～52 min， 69%(A)+31%(B)； 52～53 min， 35%(A)+65%(B)； 53～69 min， 100%(B)； 69～76 min， 69%(A)+31%(B)(百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

利用不同試劑對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理后，使用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉，pH=8.0)洗滌通透性細(xì)胞，然后將其與0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組人參皂苷溶液反應(yīng)30 min (45 ℃)，結(jié)果如圖1所示.對照組細(xì)胞用1 mL無菌水代替透性化試劑進行處理.

由圖1可知，不同的透性化試劑對細(xì)胞產(chǎn)生的影響不同.四氯化碳組、四氯化碳+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率低于對照組，其原因可能是四氯化碳、四氯化碳+乙醇抑制了生物的修復(fù)功能[16]，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和蛋白變性； 45% span-20組、span-20+EDTA組、span-20+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率與對照組接近，這可能是45% span-20、span-20+EDTA、span-20+乙醇組未能損傷細(xì)胞膜表面蛋白，因而無法提升黑曲霉細(xì)胞的通透性作用；甲苯組、戊二醛組、乙醇組、吐溫- 60組、吐溫- 80組、EDTA組的Rh1轉(zhuǎn)化率均得到提高，其中EDTA組的轉(zhuǎn)化率最好.甲苯組、戊二醛組和乙醇組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是，這3種試劑對微生物細(xì)胞具有微毒性，能部分損傷黑曲霉的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，進而能夠促進細(xì)胞通透性的提高[17].吐溫-60組和吐溫-80組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是，去垢劑促使細(xì)胞膜自溶，從而提高了細(xì)胞通透性[14].螯合劑能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是，EDTA螯合細(xì)胞膜表面的陽離子后，失去陽離子的失活膜蛋白破壞了細(xì)胞膜的完整性，進而提高了細(xì)胞的通透性[18].

1為Rh1標(biāo)樣； 2為對照組； 3為2%甲苯； 4為2%戊二醛； 5為2% CCl4； 6為1% CCl4+2.25% EDTA； 7為1% CCl4+5%乙醇； 8為45% span-20； 9為22.5% span-20+2.25% EDTA； 10為22.5% span-20+5%乙醇； 11為0.4%吐溫- 60； 12為0.4%吐溫- 80； 13為4.5% EDTA； 14為10%乙醇圖1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4.5%、5%和6%的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理細(xì)胞時，其Rh1的產(chǎn)量不同；當(dāng)EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，其Rh1的產(chǎn)量最佳.

1為Rh1標(biāo)樣； 2為對照組； 3為1% EDTA； 4為2% EDTA； 5為3% EDTA； 6為4.5% EDTA； 7為5% EDTA； 8為6% EDTA圖2 不同質(zhì)量分類的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

2.3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

以3% EDTA為透性化試劑時，不同透性化處理時間對細(xì)胞通透性的影響，如圖3所示.由圖3可以看出，當(dāng)處理時間超過30 min時，Rh1的產(chǎn)量不再明顯增加.這表明，透性化處理30 min即可達到較好的滲透效果.

1為Rh1標(biāo)樣； 2為對照組； 3為3% EDTA處理15 min； 4為3% EDTA處理30 min； 5為3% EDTA處理45 min； 6為3% EDTA處理60 min； 7為3% EDTA處理75 min； 8為3% EDTA處理90 min圖3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

2.4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

分別采用物理法(凍融的方法、超聲的方法)、化學(xué)法(3% EDTA)、物理和化學(xué)聯(lián)合法(凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法)[13]透性化處理黑曲霉細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示.超聲與3% EDTA聯(lián)用的方法獲得通透性細(xì)胞的效果最好，其原因可能是超聲處理對細(xì)胞損傷適宜，既能提高通透性，又可避免因改變外界環(huán)境而對胞內(nèi)復(fù)合酶系造成的傷害，即促進了胞內(nèi)復(fù)合酶系與底物的結(jié)合反應(yīng)；凍融法、化學(xué)法、凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法以及凍融+超聲+化學(xué)的方法對Rh1的產(chǎn)量影響不大，均與對照組相似，這可能是凍融的過程能夠引起蛋白交聯(lián)，從而導(dǎo)致蛋白變性[19].

1為Rh1標(biāo)樣； 2為對照組； 3為凍融法； 4為超聲法； 5為3% EDTA法； 6為凍融+超聲的方法； 7為凍融+3% EDTA的方法； 8為超聲+3% EDTA的方法； 9為凍融+超聲+3% EDTA的方法圖4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

2.5 產(chǎn)物的HPLC檢測

取待測樣品(2.1中4.5% EDTA樣品、2.2中3% EDTA樣品、2.3中30 min樣品、2.4中超聲+3% EDTA樣品)的正丁醇層溶液0.9 mL，蒸干后溶解于5 mL甲醇中(稀釋5.56倍).各取10 μL待測樣品進行HPLC檢測，結(jié)果如圖5所示.采用單點校準(zhǔn)法[20]對得到的峰面積數(shù)據(jù),按照公式Ci=Cs×Si/Ss計算Rh1的濃度值，結(jié)果如表2所示.上式中Ci和Cs分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的濃度(mg·mL-1)，Si和Ss分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的峰面積(mAU). 由圖5 B —圖5 E可知， 4種樣品的出峰保留時間(25.150、25.242、25.008、25.287 min)與Rh1標(biāo)樣(圖5 A,25.310 min)基本一致，這表明透性化處理黑曲霉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中有Rh1生成.由表2可知，超聲+3% EDTA聯(lián)用方法的通透性效果最好.

表2 單點矯正法測得的樣品濃度

A為Rh1標(biāo)樣； B為不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞的13號樣品(4.5% EDTA)； C為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞的5號樣品(3% EDTA)； D為不同透性化處理時間處理黑曲霉細(xì)胞的4號樣品(30 min)； E為不同透性化處理方法處理黑曲霉細(xì)胞的8號樣品(超聲+3% EDTA)圖5 產(chǎn)物的HPLC檢測圖

3 結(jié)論

本文使用不同透性化試劑、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試劑、不同透性化處理時間以及不同的透性化方法對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理以制備稀有人參皂苷Rh1.通過薄層層析檢測和HPLC分析表明， 聯(lián)合3% EDTA與超聲法(53 kHz)時，Rh1的制得效果最好.這表明該方法能在保證細(xì)胞完整性的前提下，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，進而使底物能夠進入細(xì)胞內(nèi)與復(fù)合酶結(jié)合反應(yīng).該方法對細(xì)胞毒性小，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，實用性強.另外，用三七的三醇型常量人參皂苷(Re、Rg1、R1)作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物，可節(jié)省分離和純化單一常量人參皂苷成分的時間和成本，因此本文方法為制備Rh1提供了新的思路.