侯衍豹 楊勇，2 容蓉 孫啟慧 蔣海強(qiáng) 李榮榮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250355）

偏最小二乘法（PLS）建模分析麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)腎陽(yáng)虛外感小鼠的干預(yù)作用

侯衍豹1楊勇1，2容蓉1孫啟慧1蔣海強(qiáng)1李榮榮1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250355）

目的：采用偏最小二乘法（PLS）整體判斷麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠外感模型的干預(yù)作用。方法：KM雄性小鼠91只隨機(jī)分空白對(duì)照組、模型組、利巴韋林組、連花清瘟組和麻黃細(xì)辛附子湯（MXF）低、中、高、劑量組。除空白對(duì)照組外其余各組小鼠采用腹腔注射苯甲酸雌二醇（8mg/kg）法復(fù)制腎陽(yáng)虛小鼠模型，采用流感病毒FM1尿囊液（血凝滴度為1：320）滴鼻感染小鼠，建立腎陽(yáng)虛小鼠外感模型。感染1d后各組分別給藥，每日1次，共6d。觀察各組小鼠的體重、肛溫變化。采用SIMCA-P軟件處理小鼠的體重、肛溫、各臟器指數(shù)、死亡率等指標(biāo)，應(yīng)用偏最小二乘法通過(guò)整體評(píng)價(jià)，綜合判斷造模情況及不同藥物的干預(yù)效果。結(jié)果：PLS分析處理表明，與空白對(duì)照組比較，模型組綜合藥效分值顯著較低（P＜0.01）；各給藥組綜合藥效分值與模型組比較都有顯著性差異（P＜0.01），各給藥組都表現(xiàn)出了一定的治療效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量效果更佳。結(jié)論：采用PLS分析方法對(duì)腎陽(yáng)虛外感模型及各組藥物干預(yù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，能較好地反映證候及中藥復(fù)方整體調(diào)控作用的特點(diǎn)，避免某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)容易引起片面結(jié)論的弊端。

麻黃細(xì)辛附子湯 流行性感冒 腎陽(yáng)虛 數(shù)學(xué)建模 綜合藥效評(píng)價(jià) 臟器指數(shù) KM小白鼠 實(shí)驗(yàn)研究

流行性感冒是由流感病毒引起的上呼吸道病毒感染性疾病，發(fā)病率高，潛伏期短，易暴發(fā)流行，是人類(lèi)最常見(jiàn)的上呼吸道感染性疾病之一［1］。我國(guó)傳統(tǒng)治療感冒的中成藥對(duì)流感引起的癥狀療效好，且能標(biāo)本兼治，毒副作用相對(duì)較小。流感的高發(fā)病人群多屬于中醫(yī)學(xué)腎陽(yáng)虛者［2］，對(duì)于此類(lèi)人群服用單純治療流感的藥物是否見(jiàn)效及效果如何尚不明確，偏最小二乘法（PLS）目前是一種較先進(jìn)的多元分析方法，主要用于解決化學(xué)樣本分析中存在的變量多重相關(guān)，以及解釋變量多于樣本點(diǎn)等實(shí)際問(wèn)題，能夠解決許多普通多元回歸方法無(wú)法解決的問(wèn)題，其應(yīng)用不斷擴(kuò)展，涉及化學(xué)、機(jī)械、生物、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域［3］。本實(shí)驗(yàn)選用目前在季節(jié)性流感治療中主流的中成藥之一連花清瘟膠囊，和西藥利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照藥，以《傷寒論》中所記載的治療少陰病兼表證（及腎陽(yáng)虛外感）的經(jīng)方麻黃細(xì)辛附子湯作為受試藥，來(lái)比較它們對(duì)腎陽(yáng)虛外感的治療效果差異，并采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法（PLS）回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)建模分析，避免選用某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)易引起片面結(jié)論的弊端，目的是通過(guò)PLS分析方法對(duì)藥理模型及藥物干預(yù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)為中醫(yī)臨床上辨證選方、辨病用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物KM小白鼠，雄性，體重（20±2）g，SPF級(jí)，由山東魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20080002。

1.2 試劑與藥物苯甲酸雌二醇，寧波第二激素廠，批號(hào)140627；流感病毒甲型（FluA，北京地方株引自中國(guó)CDC病毒病研究所）；利巴韋林顆粒，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)131210；麻黃、炮附子、細(xì)辛，濟(jì)南市建聯(lián)中藥有限公司中藥飲片廠，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)；連花清瘟膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)130144）。

1.3 儀器智能恒溫控制儀（成都泰盟科技有限公司），DT-880B型手持式人體表面溫度快速篩檢儀（深圳市華盛昌機(jī)械實(shí)業(yè)有限公司），ZIL-2型小鼠自主活動(dòng)儀（北京醫(yī)科院藥研所），01193-YP601N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組小鼠按體重和肛溫隨機(jī)分成腎陽(yáng)虛外感組（模型組）、利巴韋林組、連花清瘟組、麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組，并設(shè)空白對(duì)照組。

2.2 造模與給藥

2.2.1 腎陽(yáng)虛模型參考文獻(xiàn)［4］的方法并改進(jìn)造模劑量，20mL/kg腹腔注射0.4mg/mL苯甲酸雌二醇稀釋液，每日1次，連續(xù)15d，復(fù)制腎陽(yáng)虛模型?？瞻讓?duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水20mL/kg。于造模12～13d進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定自主活動(dòng)、肛溫、趾溫、游泳時(shí)間［2］，以判定模型成功與否。

2.2.2 腎陽(yáng)虛外感模型將復(fù)制成功的腎陽(yáng)虛模型小鼠用流感病毒FM1雞胚尿囊液（血凝滴度為1∶320）50μL/只滴鼻感染，空白對(duì)照組小鼠滴鼻接種等量生理鹽水。

2.2.3 給藥第0日為接種病毒前，第1日接種流感病毒，2～7d為藥物干預(yù)治療。小鼠灌胃量為10mL/kg，利巴韋林組予0.0625g/kg利巴韋林，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組分別予2.5、12.5、25g/kg麻黃細(xì)辛附子湯，連花清瘟組予0.525g/kg蓮花清瘟膠囊，空白對(duì)照組、模型組灌服蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥6d。

2.3 觀察指標(biāo)每日測(cè)量接種流感病毒后小鼠的體溫、體重1次，記錄變化趨勢(shì)，并觀察過(guò)程中小鼠的臨床癥狀如精神狀況、活動(dòng)度、飲食等變化，并記錄過(guò)程中每組動(dòng)物的死亡數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取各組小鼠肺、脾、胸腺等組織，稱(chēng)取臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法單因素方差分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏最小二乘法分析：采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法（PLS）對(duì)各組綜合藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠體重變化空白對(duì)照組小鼠體重明顯增長(zhǎng)；從接種流感病毒起，腎陽(yáng)虛外感模型組小鼠體重呈持續(xù)降低趨勢(shì)直到第7日未見(jiàn)恢復(fù)，造模第2日起體重與空白對(duì)照組小鼠比較，有顯著性差異（P＜0.01）；利巴韋林組小鼠體重雖開(kāi)始呈降低的趨勢(shì)，但之后逐漸恢復(fù)，藥物干預(yù)第3日起已明顯高于模型組（P＜0.05）；麻黃細(xì)辛附子湯不同劑量組小鼠體重呈明顯上升趨勢(shì)，自干預(yù)第3日起明顯高于模型組（P＜0.05），干預(yù)第4日起與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

3.2 各組小鼠肛溫變化從接種病毒到第5日空白對(duì)照組小鼠肛溫明顯高于其他組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；接種病毒第1～5日模型組小鼠肛溫較空白對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物治療組小鼠肛溫于接種病毒第4日起明顯升高（P＜0.05），麻黃細(xì)辛附子湯各劑量組相對(duì)于其他給藥組有升高的趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 各組小鼠體重變化比較

圖2 各組小鼠肛溫變化比較

3.3 各組小鼠死亡率、肺指數(shù)比較與模型組比較，各組藥物均有不同程度降低小鼠死亡率的作用，而麻黃細(xì)辛附子湯中、高劑量能夠顯著性降低腎陽(yáng)虛外感小鼠的死亡率。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺指數(shù)明顯增大（P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5-6］；與模型組比較，各給藥組小鼠肺指數(shù)明顯降低（P＜0.05），表明經(jīng)藥物干預(yù)后肺感染程度明顯改善。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠死亡率、肺指數(shù)比較

3.4 采用PLS對(duì)各組綜合藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析

3.4.1 對(duì)本實(shí)驗(yàn)7個(gè)組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理自變量表見(jiàn)表2。

表2 腎陽(yáng)虛外感模型指標(biāo)變量標(biāo)識(shí)表

3.4.2 得分圖及VIP變量投影重要性指標(biāo)綜合藥效得分圖見(jiàn)圖3。變量投影重要性指標(biāo)用來(lái)描述自變量對(duì)因變量的解釋能力，VIP值越大，自變量x對(duì)y的解釋能力越強(qiáng)。用VIP值大于1的變量建立藥物對(duì)腎陽(yáng)虛外感干預(yù)作用PLS回歸模型。y=0.148X23-0.11X25+0.165X9+0.159X10-0.029X17+ 0.156X11+0.15X12+0.025X27+0.025X28+0.025X29+ 0.025X30-0.015X16-0.016X4。見(jiàn)圖4。各組小鼠綜合藥效分值比較見(jiàn)圖5。

圖3 各組小鼠綜合藥效得分圖

從結(jié)果可以看出，各給藥組綜合藥效分值與模型組比較都有顯著性差異（P＜0.01）。與空白對(duì)照組相比模型組綜合藥效分值顯著較低（P＜0.01），根據(jù)得分圖可以看出空白對(duì)照組、模型組能顯著分開(kāi)，說(shuō)明腎陽(yáng)虛外感模型的制備可行，反映出明顯的病理?yè)p傷狀態(tài)。給藥組相對(duì)于模型組都表現(xiàn)出了一定的治療效果，根據(jù)各給藥組綜合藥效分值比較圖可以看出綜合藥效分值平均數(shù)越接近空白對(duì)照組、遠(yuǎn)離模型組綜合藥效學(xué)效果越顯著，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量都表現(xiàn)出了良好的藥效效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量尤佳。

圖4 陽(yáng)虛外感模型VIP直方圖

圖5 各組小鼠綜合藥效分值比較圖（±s）

4 討論

本研究采用連花清瘟膠囊作為中藥對(duì)照藥，考慮原因有二：其一，治療外感疾病，連花清瘟膠囊作為復(fù)方中藥，具有多成分、多靶點(diǎn)的中藥作用特點(diǎn)，且研究發(fā)現(xiàn)，“對(duì)于甲型H1N1流感，連花清瘟在縮短病程和減少病毒載量上與奧司他韋療效相似，可作為治療H1N1病毒感染的另一有效藥物，連花清瘟膠囊可以顯著改善病毒性肺炎小鼠的癥狀和存活率，可降低細(xì)胞因子表達(dá)水平，從而改善肺部炎癥［7］。其二，連花清瘟膠囊可“用于治療流行性感冒屬熱毒襲肺證”，與本研究的腎陽(yáng)虛外感證還是具有較大的區(qū)別，所以運(yùn)用連花清瘟膠囊和麻黃細(xì)辛附子湯分別干預(yù)腎陽(yáng)虛外感小鼠模型，它們的作用差別也從另一個(gè)角度反映出“方證相應(yīng)”的必要性，本研究的綜合藥效評(píng)價(jià)也反映出這點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，模型組動(dòng)物由于接種了流感病毒出現(xiàn)了肺部水腫、充血、炎癥等癥狀，導(dǎo)致肺指數(shù)相對(duì)于空白對(duì)照組升高并出現(xiàn)了較高的死亡率，各給藥組都有降低肺指數(shù)及死亡率的趨勢(shì)，說(shuō)明各給藥組都有改善肺部炎癥提高小鼠存活率的效果。模型組動(dòng)物為腎陽(yáng)虛體征，其機(jī)體免疫功能下降，脾、胸腺、腎上腺作為體內(nèi)重要的免疫器官，其臟器指數(shù)呈降低趨勢(shì)。本研究綜合中醫(yī)的證模型（腎陽(yáng)虛）和西醫(yī)的致病因素（流感病毒FM1鼻腔滴注感染），建立了病證結(jié)合的腎陽(yáng)虛外感模型，通過(guò)整體的外觀狀況、生理狀態(tài)、自主活動(dòng)、被動(dòng)負(fù)重游泳等指標(biāo)，結(jié)合趾溫、肛溫動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，感染病毒后死亡率比較，肺組織病理改變綜合評(píng)價(jià)，較好地模擬了臨床腎陽(yáng)虛外感的病證狀態(tài)。

動(dòng)物的動(dòng)態(tài)生理指標(biāo)雖然比較簡(jiǎn)單，但能直接和準(zhǔn)確地反映機(jī)體健康狀態(tài)，再結(jié)合肺指數(shù)、死亡率等客觀的金指標(biāo)能快速地判斷出模型的狀態(tài)及藥物干預(yù)的大體效果；另外，這種整體動(dòng)態(tài)的生理、病理指標(biāo)評(píng)價(jià)也較符合中醫(yī)“證候”的特點(diǎn)（動(dòng)態(tài)的、疾病階段性的、外觀癥狀為主的描述表征）。但目前有關(guān)中醫(yī)證候、中藥復(fù)方的藥效評(píng)價(jià)常局限于某個(gè)指標(biāo)或某幾個(gè)指標(biāo)的判斷，有時(shí)會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)或部分有顯著性差異的結(jié)果來(lái)判斷，容易導(dǎo)致以偏概全或片面的結(jié)論。我們采用的PLS統(tǒng)計(jì)分析，目的是將相關(guān)的藥效指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用數(shù)學(xué)建模，綜合起來(lái)進(jìn)行比較分析（類(lèi)似于綜合測(cè)評(píng)模式），可更客觀地評(píng)價(jià)復(fù)合病證動(dòng)物模型及中藥復(fù)方的整體療效。

本實(shí)驗(yàn)使用SIMCA-P軟件中的PLS來(lái)處理藥理學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)得分圖可以看出空白對(duì)照組及腎陽(yáng)虛外感組在二維圖上區(qū)分很明顯，說(shuō)明腎陽(yáng)虛外感模型制備較好。VIP圖中可以看出死亡率、肛溫、肺指數(shù)等指標(biāo)對(duì)綜合藥效結(jié)果的影響是最大的，這與藥理學(xué)分析判斷方法一致。各給藥組綜合藥效得分及比較圖可以看出麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組相對(duì)于其他給藥組表現(xiàn)出了更好的治療效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組治療效果尤佳。中劑量相當(dāng)于臨床的等效劑量，這也提示麻黃細(xì)辛附子湯使用時(shí)要注意選擇合適的劑量范圍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用PLS來(lái)分析處理藥理學(xué)數(shù)據(jù)簡(jiǎn)便可靠，能較好地反映證候特征及中藥復(fù)方的整體調(diào)控作用，避免某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)容易引起片面結(jié)論的弊端，為中醫(yī)臨床上辨證選方、辨病用藥提供了更客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］李世宏，梁紀(jì)蘭，楊銳樂(lè)，等.中藥抗流感病毒研究進(jìn)展.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007，26（5）：26

［2］楊勇.腎陽(yáng)虛外感小鼠模型建立及麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)研究.濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012

［3］王惠文，吳載斌.偏最小二乘回歸的線(xiàn)性與非線(xiàn)性方法.北京：國(guó)防工業(yè)出版社，2006：9

［4］陳素紅，呂圭源，范景，等.海馬不同提取物對(duì)雌二醇致腎陽(yáng)虛小鼠的影響.中草藥，2009（2）：258

［5］劉培民，張鴻彩，包培蓉．升降散抗流感病毒實(shí)驗(yàn)研究．山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，25（1）：43

［6］閆懷士，李京培．艾灸抗小鼠流感病毒性肺炎的實(shí)驗(yàn)研究.上海針灸雜志，2006，25（7）：43

［7］鐘南山.從SARS到H7N9——中醫(yī)藥治療的啟發(fā).第十屆國(guó)際絡(luò)病學(xué)大會(huì)會(huì)議報(bào)告

R511.605

A

1672-397X（2015）11-0079-04

侯衍豹（1990—），男，碩士研究生，從事中藥及復(fù)方藥理和毒理研究。595044561@qq.com

楊勇，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。yy7204@163.com

2015-06-08

編輯：吳寧

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273626）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX09509001-001）；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（XTCX2014B-02）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃（2013-026）；山東省教育廳科技發(fā)展計(jì)劃（J10LF20）