朱國(guó)光(淮安市第一人民醫(yī)院分院，淮安市耳鼻喉醫(yī)院藥劑科，江蘇淮安 223002)

單磷酸阿糖腺苷屬于人工合成的嘌呤核苷酸類化合物，是阿糖腺苷的磷酸化產(chǎn)物，臨床上主要用于治療皰疹病毒和肝炎病毒感染所致的皮炎、口炎、腦炎和巨細(xì)胞病毒感染等疾病［1-4］。目前，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局“新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第27冊(cè)”，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):WS1-(X-061)-2001Z，但未對(duì)其有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定進(jìn)行相關(guān)規(guī)定。為貫徹藥品質(zhì)量安全、有效、可控的目標(biāo)，保障人民群眾用藥安全，本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定注射用單磷酸阿糖腺苷中的主要雜質(zhì)阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，該法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2998型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)沃特世公司);梅特勒XS64電子天平(萬(wàn)分之一，美國(guó)梅特勒-托利多公司);PRO-R雙級(jí)反滲透超純水機(jī)(上海礫鼎水處理設(shè)備有限公)。

1.2 藥品與試劑

甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)，實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉為分析純(國(guó)藥集團(tuán));單磷酸阿糖腺苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):140710-201002)，阿糖腺苷(上海萬(wàn)疆生物技術(shù)有限公司，批號(hào):Z0119)，腺嘌呤(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110886-201102)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:甲醇-磷酸鹽緩沖液(V∶V=20∶80，磷酸氫二鈉26.9 g+磷酸二氫鈉29.3 g溶于超純水，并定容至1000 ml);流速:1 ml/min;進(jìn)樣量:10 μl;檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷、腺嘌呤均能很好地分離，保留時(shí)間分別為5.6、13.3和22.1 min，理論塔板數(shù)分別為8754、6570和8855，分離度均 ＞3，見(jiàn)圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱取單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷、腺嘌呤49.8、50.3、50.5 mg，分別置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至10 ml，得到對(duì)照品溶液;分別精密量取對(duì)照品溶液1 ml，分別置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至10 ml，得到對(duì)照品使用液，質(zhì)量濃度分別為 498、503、505 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備:精密稱取注射用單磷酸阿糖腺苷0.5117 g，置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至10 ml，樣品溶液質(zhì)量濃度為51.17 mg/ml;精密量取1 ml樣品溶液，置于100 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至100 ml，得供試品溶液，質(zhì)量濃度為511.7 μg/ml。

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 酸破壞試驗(yàn):取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 ml，置于40℃恒溫水浴鍋中30 min，放冷至室溫(25℃)，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，然后用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。

圖1 主峰與已知雜質(zhì)峰色譜圖Fig 1 The chromatograms of main peak and impurity peaks

2.4.2 堿破壞試驗(yàn):取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，置于40℃恒溫水浴鍋30 min，放冷至室溫，用0.5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，然后用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。

2.4.3 加熱破壞試驗(yàn):稱取注射用單磷酸阿糖腺苷約5 g，置于105℃烘箱中2 h;精密稱取經(jīng)烘烤的樣品10.3 mg，置于25 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。

2.4.4 光照試驗(yàn):稱取注射用單磷酸阿糖腺苷約5 g，鋪平后置于照度為4500 Lx下照射24 h;精密稱取經(jīng)照射的樣品10.5 mg，置于25 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。

2.4.5 氧化破壞試驗(yàn):取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入30%過(guò)氧化氫溶液1 ml，然后用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。

專屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用單磷酸阿糖腺苷對(duì)酸破壞試驗(yàn)和光照試驗(yàn)不敏感，對(duì)堿破壞試驗(yàn)、加熱破壞試驗(yàn)和氧化破壞試驗(yàn)高度敏感，見(jiàn)圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatogram of specificity test

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品使用液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 ml，分別置于 100 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相稀釋并定容至100 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作。以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:A阿糖腺苷=384.511 C+12.735，R2=0.9998，線性范圍為 0.503 ～ 20.120 μg/ml;A腺嘌呤=563.847 C+15.674，R2=0.9999，線性范圍為0.505 ～20.200 μg/ml。

2.5.2 檢出限和定量限:以信噪比(S/N)=3∶1為檢出限，S/N=10∶1為定量限，逐步吸收供試品溶液，計(jì)算得阿糖腺苷、腺嘌呤的檢出限分別為0.89、1.04 ng，定量限分別為3.01、3.45 ng。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn):取樣品批號(hào)為20140511的樣品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，平行試驗(yàn)6份，測(cè)定樣品中阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，結(jié)果分別為0.19%(RSD=0.22%)、0.21%(RSD=0.19%)。

2.5.4 回收率試驗(yàn):分別取“2.3.2”項(xiàng)下樣品溶液1 ml置于9個(gè)50 ml容量瓶中，分別取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.8、0.8、0.8、1.0、1.0、1.0、1.2、1.2 和 1.2 ml，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測(cè)定試樣中阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，結(jié)果分別為99.8%(RSD=0.21%)、100.1%(RSD=0.20%)。

2.6 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定3批注射用單磷酸阿糖腺苷中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 注射用單磷酸阿糖腺苷中有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果(%)Tab 1 Determination result of related substances in vidarabine monophosphate(%)

3 討論

有關(guān)物質(zhì)主要是指在生產(chǎn)過(guò)程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應(yīng)產(chǎn)物，以及貯藏過(guò)程中的降解產(chǎn)物等［5-9］。有關(guān)物質(zhì)的研究是藥品質(zhì)量研究中關(guān)鍵性的項(xiàng)目之一，其含量是反映藥品純度的直接指標(biāo)。藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，有時(shí)與藥品中存在的雜質(zhì)也有很大關(guān)系［10-13］。單磷酸阿糖腺苷是以阿糖腺苷、腺嘌呤和磷酸為原料合成的藥物，首先，阿糖腺苷和腺嘌呤在酶的作用下，生成阿糖腺苷中間產(chǎn)物，經(jīng)提取、濃縮、精制得到高純度的阿糖腺苷;然后，阿糖腺苷經(jīng)磷酸化得到單磷酸阿糖腺苷。由其生成工藝過(guò)程可見(jiàn)，阿糖腺苷和腺嘌呤在精制過(guò)程中難以除盡;另外，單磷酸阿糖腺苷在儲(chǔ)藏中受溫度、濕度等外界環(huán)境條件的影響，可分解產(chǎn)生阿糖腺苷和腺嘌呤，成為主要雜質(zhì)成分，對(duì)藥物的療效和安全性構(gòu)成潛在的風(fēng)險(xiǎn)［14-16］。目前，注射用單磷酸阿糖腺苷的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)的規(guī)定。

本研究結(jié)合單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷和腺嘌呤的紫外光譜圖，確定3種化合物在260 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，因此，選擇260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用依利特Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)、柱溫為30℃、流動(dòng)相為甲醇-磷酸鹽緩沖液時(shí)，樣品中各色譜峰分離度好，峰對(duì)稱性好，因此，本研究采用以上色譜條件。本研究結(jié)果表明，注射用單磷酸阿糖腺苷對(duì)堿、高溫和氧化敏感，主要功效成分會(huì)顯著降低或完全被破壞。

綜上所述，本法用于測(cè)定注射用單磷酸阿糖腺苷的有關(guān)物質(zhì)，分離度高、理論塔板數(shù)高、峰對(duì)稱性好、檢出限低、重現(xiàn)性高，已知雜質(zhì)成分線性方程相關(guān)系數(shù)高，可用于實(shí)踐檢測(cè)、控制注射用單磷酸阿糖腺苷的質(zhì)量，保障其臨床療效，同時(shí)提高用藥安全性。

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