于善一 鐘友剛 施振聲

目前，犬精子的傳統(tǒng)慢速冷凍法雖已廣泛應(yīng)用，但仍存在諸多不足。超快速冷凍法可以實(shí)現(xiàn)精子玻璃化，有望進(jìn)一步提高冷凍質(zhì)量。研究分別以蔗糖濃度為0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M等滲溶液（約300mOsm/L）作為冷凍液，利用微粒法對(duì)犬精子進(jìn)行超快速冷凍，并對(duì)復(fù)蘇后精子的總活力、存活率、頂體完整性、畸形率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，0.125M蔗糖組的總活力為40.1±2.0%，存活率60.4±2.8%，頂體完整性65.6±10.5%，存在顯著優(yōu)勢(shì)。超快速冷凍法能夠消除傳統(tǒng)方法中冷凍保護(hù)劑的毒性和污染，操作快捷、經(jīng)濟(jì)，但冷凍效果仍存在相當(dāng)?shù)奶嵘臻g，值得進(jìn)一步研究與探討。

一、概述

精子冷凍技術(shù)是犬繁殖項(xiàng)目中的重要技術(shù)。通過(guò)液氮對(duì)預(yù)處理后的精子進(jìn)行超低溫冷凍可以保存優(yōu)良品種、提高繁殖效率、降低傳染病風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)典的犬精子冷凍技術(shù)需要添加甘油、卵黃或低密度脂蛋白等，作為精子的冷凍保護(hù)劑，同時(shí)應(yīng)用價(jià)格昂貴的程序化冷凍儀進(jìn)行“慢速”冷凍，全過(guò)程耗時(shí)3～4小時(shí)。另外，甘油作為一種滲透性冷凍保護(hù)劑的添加會(huì)直接引起細(xì)胞毒性，進(jìn)而影響受孕率。而現(xiàn)在已有研究者利用超快速冷凍法進(jìn)行人精子冷凍保存，并獲得成功。該方法應(yīng)用玻璃化冷凍的原理，最大程度減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，同時(shí)避免了甘油等滲透性冷凍保護(hù)劑的使用，高效、快速、成本低廉。本研究嘗試將超快速冷凍法應(yīng)用于犬精子冷凍保存，以求為今后犬繁殖相關(guān)科研、臨床項(xiàng)目提供參考。

二、材料

（一）試驗(yàn)動(dòng)物

選 用2～6 歲 公 犬4 頭( 雜 種犬），飼喂全價(jià)日糧食。試驗(yàn)前均經(jīng)過(guò)3～5 次訓(xùn)練，可以順利進(jìn)行人工按摩法采精且對(duì)操作耐受良好。同一犬采精間隔5 天或以上。精子活力大于80%的精液可作為試驗(yàn)樣本。

（二）試驗(yàn)試劑

自配人輸卵管液（human tubal fluid，HTF） 、蔗糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、吉姆薩染液、中性紅、甲醛、鹽酸。

（三）主要儀器

Olympus CX41 相 差 顯 微 鏡、Makler Counting Chamber 精子計(jì)數(shù)板、20 目篩等。

三、試驗(yàn)方法

（一）精液采集與預(yù)處理

人工按摩法采精后，對(duì)精子活力、密度、畸形率、存活率（低滲膨脹試驗(yàn)）、頂體完整性（吉姆薩染色）進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)以700g離心5min 后，棄上清并用HTF 重懸沉淀，調(diào)整精子重懸液密度為100x106/ml。室溫下保存。

（二）冷凍液準(zhǔn)備

將0.3M 蔗糖水溶液與HTF 以6 種不同比例混合作為冷凍液，并以20:1的比例加入預(yù)先處理的精液（終密度5x106/ml）后，使冷凍液中蔗糖的終濃度分別達(dá)到0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M。同時(shí)添加1%BSA。

（三）冷凍設(shè)備準(zhǔn)備

將20 目篩放入泡沫箱中后注入液氮，使液面高3～5cm。靜置5min 后備用。

（四）冷凍過(guò)程

方 法 依 照Isachenko（2008）。將配置好的精子懸液于液氮上方8cm 處懸置30s 后，用30μl 移液器以45°角滴入液氮中，使液滴形成小的固態(tài)顆粒。待顆粒沉入篩網(wǎng)中后，加入下一滴。用1.8ml 冷凍管收集顆粒，與液氮中保存24h 以上。

（五）解凍

將5個(gè)顆粒依次投入4ml 預(yù)熱37℃的HTF（含1%BSA）中，輕輕搖晃8s 后，于37℃水浴3min。

（六）評(píng)估

對(duì)解凍后精子的總活力、存活率、頂體完整性、畸形率進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用吉姆薩染色法進(jìn)行頂體完整性評(píng)價(jià)。具體評(píng)價(jià)方法參考WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen，5th ed。

（七）統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 21 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素ANOVA 中的最小差異性顯著法（Least Significant Difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析，并以a（P<0.05）和b（P<0.01）表示。試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。

四、結(jié)果

新鮮精液總活力83.8±3.2%，頂體完整性96.4±1.2%，存活率90.8±0.6%，畸形率16.4±5.6%?？焖倮鋬龊笤u(píng)估結(jié)果如表1。冷凍后各組精子總活力、存活率、頂體完整性與新鮮精液相比均存在極顯著差異（P<0.01），畸形率之間無(wú)差異（P>0.05）。

表1 不同蔗糖濃度對(duì)精子超快速冷凍效果的影響（%）

（一）總活力

以0M 組 為 對(duì) 照 組，0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 組 與之相比差異顯著。另外，根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，0.125M 組與其他各組的精子總活力均存在顯著差異（P<0.05）。

（二）存活率

以0M 組 為 對(duì) 照 組，0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 組 與 之 存 在顯著差異。另外，除0.15M 組、0.2M 組外，其他各組的精子存活率與0.125M 組相比存在顯著差異（P<0.05）。

（三）頂體完整性

以0M 組為對(duì)照組，僅0.125M組的精子頂體完整性與之存在顯著差異（P<0.05）。

（四）畸形率

各組之間的精子畸形率無(wú)顯著差異（P>0.05）。

五、分析討論

研究設(shè)置6 組滲透壓相似（約300mOsm/L）的蔗糖-HTF 溶液并以此作為冷凍液，對(duì)微量精子（5x106/ml）進(jìn)行超快速冷凍（方法參考自Sánchez）。試驗(yàn)選用總活力、頂體完整性、存活率、活力等基本精子評(píng)估指標(biāo)，對(duì)冷凍效果進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。將其中主要結(jié)果繪制為柱狀圖，見圖1，其中Control 為0M 組，即無(wú)蔗糖組。如圖所示，應(yīng)用超快速冷凍方法進(jìn)行犬精子冷凍時(shí)，各組復(fù)蘇后精子均有一定的活力。但0.125M 組在精子總活力、存活率、頂體完整性方面均具有優(yōu)勢(shì)。2011年，Sánchez 等在犬精子超快速冷凍研究中設(shè)立了0.05M、0.125M、0.2M 三組濃度蔗糖并評(píng)價(jià)冷凍效果差異，結(jié)果表明0.125M 組具有明顯優(yōu)勢(shì)，精子活力可達(dá)42.5 ± 2.3%。但是，該三組蔗糖設(shè)置對(duì)應(yīng)的滲透壓約為200mOsm/L、275mOsm/L、350mOsm/L。由于犬精子對(duì)滲透壓的敏感性較高，因此在冷凍之前精子就可能由于高滲或低滲而受損進(jìn)而喪失活力。因此，本試驗(yàn)設(shè)立等滲蔗糖梯度試驗(yàn)，即配制0.05M 至0.25M 等6 組蔗糖濃度的同時(shí)，保持各組滲透壓的相似性。

圖1 不同蔗糖濃度的冷凍效果差異對(duì)比

有研究者分別利用NaCl、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、乙二醇、DMSO 等物質(zhì)提高溶液滲透壓，針對(duì)犬精子的滲透壓耐受性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，添加NaCl 并引起的滲透壓增高至500mOsm/L 時(shí)，犬精子活力或質(zhì)膜完整性均降至約30%；高于700mOsm/L 時(shí)則幾乎完全喪失活力。而不同的單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）使?jié)B透壓上升至500mOsm/L 時(shí)，精子質(zhì)膜完整性仍保持約70%，但活力下降至約40%。這意味著高濃度的冷凍保護(hù)劑雖然理論上有助于精子冷凍效果，但本身具有的高滲透壓可能使犬精子提前喪失活力。因此在冷凍液設(shè)計(jì)上需要加以平衡。

所謂“超快速冷凍法”是實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子玻璃化冷凍的具體方法?！俺焖佟币辉~與傳統(tǒng)冷凍的“慢速”相區(qū)別，其過(guò)程中無(wú)需平衡，亦無(wú)程序降溫，而是直接將樣本放入液氮或-160℃環(huán)境中。慢速冷凍的降溫時(shí)間為2～3 小時(shí)，而超快速冷凍最低僅為5 秒。研究者通過(guò)不同的冷凍載體，以實(shí)現(xiàn)快速降溫。如嘗試使用5mm 直徑的銅環(huán)、鋁箔表面顆粒冷凍、開放式拉長(zhǎng)細(xì)管、開放式細(xì)管、微滴法、Cell Sleeper 等對(duì)人類精子進(jìn)行超快速冷凍。各種方法均以實(shí)現(xiàn)精子玻璃化為目的，但最終效果有所差異。Mazur 于1972年提出“雙因子假說(shuō)”認(rèn)為，細(xì)胞在冷凍過(guò)程中要平衡滲透壓變化與冰晶形成兩大因素。但玻璃化觀點(diǎn)的提出和實(shí)踐在一定程度上跨越了雙因子假說(shuō)的討論范圍，以新的視角討論冷凍保護(hù)與冷凍損傷。

“玻璃化”本是自然存在的一種物理過(guò)程，在嚴(yán)寒氣候下生存多種昆蟲或兩棲類動(dòng)物體內(nèi)多存在這種現(xiàn)象。燈蛾毛蟲在一年中有10個(gè)月冰凍在-50℃環(huán)境中卻仍然可以生存。某些品種的青蛙體內(nèi)65%水分凍結(jié)后，依然可以存活數(shù)日甚至數(shù)周。有些動(dòng)物如北極蛙類可以通過(guò)分泌胰島素刺激葡萄糖釋放并進(jìn)入細(xì)胞，同樣可對(duì)機(jī)體形成保護(hù)。而甘油、葡萄糖蔗糖這類物質(zhì)則被認(rèn)為是一種“冷凍保護(hù)劑”，可以使動(dòng)物的體液在低溫時(shí)固化卻不形成晶體——這便是玻璃化轉(zhuǎn)變的過(guò)程。從熱力學(xué)角度講，隨著溫度降低，液體開始向固體轉(zhuǎn)變，若該過(guò)程中液體的分子排布和熱力學(xué)狀態(tài)并不發(fā)生改變，則溶液會(huì)形成一種無(wú)冰晶的高粘滯“玻璃態(tài)”，這一過(guò)程被稱為玻璃化。研究表明，玻璃態(tài)的形成與冷凍保護(hù)劑的濃度、降溫速度、終溫度相關(guān)，不論是滲透性冷凍保護(hù)劑還是非滲透性冷凍保護(hù)劑，其濃度越高，則玻璃化所需要的降溫速度越慢。但是，精子無(wú)法耐受高濃度滲透性冷凍保護(hù)劑，因此可嘗試通過(guò)高速降溫和復(fù)溫過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外溶液的玻璃化。這種思路已在實(shí)踐中得到證實(shí)。

六、結(jié)語(yǔ)

研究以HTF、0.125M 蔗糖、1%BSA為配方作為犬精子超快速冷凍的冷凍液，獲得了較好的保存效果。超快速冷凍方法以實(shí)現(xiàn)精子樣本玻璃化為目的，能夠消除傳統(tǒng)方法中冷凍保護(hù)劑的毒性和污染，操作快捷、經(jīng)濟(jì)，但冷凍效果仍存在一定的提升空間，值得進(jìn)一步研究與探討。