脫氧核酶—納米材料復(fù)合物用于生物傳感研究進(jìn)展

趙旭華+孟紅敏+龔亮+邱麗萍+張曉兵+譚蔚泓

摘 要 脫氧核酶（DNAzyme或DNA酶）是一類具有高效催化活性和特異性識(shí)別功能的DNA分子，可以通過體外篩選方式從隨機(jī)脫氧核苷酸單鏈庫(kù)中獲得，它具有催化效率高、特異性高、穩(wěn)定性好、合成簡(jiǎn)單且修飾方便等優(yōu)點(diǎn)。脫氧核酶與納米材料的結(jié)合， 既保留了脫氧核酶的催化特性和識(shí)別能力， 又引入了納米材料的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，實(shí)現(xiàn)了識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的一體化，大大促進(jìn)了生物傳感器的快速發(fā)展。本文主要介紹了金納米顆粒、石墨烯、量子點(diǎn)、磁性納米顆粒等納米材料結(jié)合脫氧核酶用于生物傳感的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 脫氧核酶； 納米材料； 生物傳感器； 評(píng)述

1 引 言

納米材料是由粒徑小于100 nm的超細(xì)顆粒構(gòu)成的零維、一維、二維、三維材料的總稱。由于納米材料具有獨(dú)特的尺寸結(jié)構(gòu)，所以有著傳統(tǒng)材料不具備的一些特征[1]：（1）表面效應(yīng) 指隨著微粒粒徑的變小， 其表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比急劇增大， 從而引起納米微粒性質(zhì)的變化。由于這些納米微粒表面原子處于嚴(yán)重的缺位狀態(tài)， 使得它易與其它原子結(jié)合， 達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，故具有很高的化學(xué)活性。（2）小尺寸效應(yīng) 指由于納米顆粒的尺寸變小所引起的光、力、熱、電、磁等宏觀物理性質(zhì)的變化。如納米顆粒的熔點(diǎn)遠(yuǎn)低于塊狀金屬的熔點(diǎn)； 當(dāng)金屬納米顆粒的直徑小于10 nm時(shí)，就會(huì)失去原有的金屬光澤，呈現(xiàn)出黑色。（3）量子尺寸效應(yīng) 指當(dāng)顆粒的尺寸下降到納米級(jí)時(shí)，費(fèi)密能級(jí)附近的電子能級(jí)就會(huì)由準(zhǔn)連續(xù)態(tài)變?yōu)榉至⒛芗?jí)，能級(jí)間的間距隨顆粒尺寸的減小而增大。當(dāng)熱能、磁場(chǎng)能或電場(chǎng)能比平均的能級(jí)間距還小時(shí)，納米微粒就會(huì)呈顯出一些與宏觀物體截然不同的特性，如由導(dǎo)電的金屬制備的納米顆?？梢宰?yōu)榻^緣體。（4）宏觀量子隧道效應(yīng) 是指微觀粒子貫穿勢(shì)壘的能力。納米材料的這些特征使其表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)、磁學(xué)以及催化性能[2，3]。目前， 納米材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于信息工程、能量?jī)?chǔ)存、生物傳感、分子器件及選擇性催化等研究領(lǐng)域， 并逐漸成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)[4～7]。

脫氧核酶（DNAzyme或DNA酶）是一類具有高效催化活性和特異性識(shí)別功能的DNA分子，可以通過體外篩選方式從隨機(jī)脫氧核苷酸單鏈庫(kù)中獲得[8～12]。脫氧核酶可以催化DNA或RNA切割、DNA水解以及DNA連接等多類反應(yīng)[7，12～15]，但常見的脫氧核酶主要包括RNA切割型脫氧核酶與G四聚體脫氧核酶兩大類。與傳統(tǒng)蛋白酶相比，脫氧核酶具有以下優(yōu)點(diǎn)： 首先，它的穩(wěn)定性高，在較高溫度下其活性不受影響；其次，脫氧核酶的相對(duì)分子量比較小且具有很高的催化效率； 此外，脫氧核酶的合成簡(jiǎn)單、修飾方便并且受酸度等環(huán)境因素影響比較小。脫氧核酶的上述優(yōu)點(diǎn)使其受到了越來越多研究者的關(guān)注，并且已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域[16～20]。如脫氧核酶可以作為一種工具酶，用于細(xì)胞水平上的基因敲除，即特異性地使某一基因失活， 然后觀察該基因在細(xì)胞生理、生化中的作用，研究該基因的功能，以便用于抗病毒、抗腫瘤的基因治療[19，20]。由于具有高效催化活性和對(duì)輔因子依賴性的特異性識(shí)別功能，脫氧核酶也可用于生物傳感器的構(gòu)建[21～23]，但如何將脫氧核酶與目標(biāo)物的識(shí)別信息轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的物理信號(hào)，一直是生物傳感研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

脫氧核酶與納米材料的結(jié)合既保留了脫氧核酶的催化特性和識(shí)別能力， 又引入了納米材料的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，實(shí)現(xiàn)了識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的一體化，有利于設(shè)計(jì)出高靈敏度、高選擇性及高效的生物傳感體系，從而為分析化學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展提供了新動(dòng)力?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，脫氧核酶已與石墨烯、納米金、量子點(diǎn)和磁性納米顆粒等納米材料廣泛結(jié)合，發(fā)展了一系列新型生物傳感器。本文將圍繞各種新型納米材料在脫氧核酶生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述。

2 脫氧核酶-納米金復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

納米金顆粒（Gold nanoparticles， AuNPs）又稱膠體金或金溶膠，具有大的比表面積、高催化活性以及尺寸依賴的光學(xué)性質(zhì)等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)[24]。納米金顆粒的制備技術(shù)與表面修飾技術(shù)的發(fā)展提高了它的穩(wěn)定性、水溶性和生物相容性，拓寬了其在生物分子標(biāo)記和檢測(cè)、納米生物傳感器以及納米生物芯片等方面的應(yīng)用[25～27]。

2.1 基于脫氧核酶-納米金顆粒的比色型傳感器的研究

納米金顆粒是在比色傳感器中常用的一種信號(hào)探針，其表面等離子體效應(yīng)與自身粒徑的大小以及顆粒之間的距離有關(guān)。當(dāng)納米金顆粒由分散狀態(tài)變?yōu)閳F(tuán)聚狀態(tài)時(shí)，其顏色會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)色或紫色。基于上述原理， 科研工作者發(fā)展了一系列比色型的脫氧核酶?jìng)鞲衅鱗28～33]。

Lu研究組[29]首次將DNAzyme通過SAu鍵共價(jià)修飾于納米金表面構(gòu)建了一種可用于檢測(cè)Pb2+的比色傳感器。如圖1A所示，底物鏈的兩端延長(zhǎng)， 便于與金納米顆粒表面修飾的DNA以頭對(duì)尾的方式雜交。當(dāng)不存在Pb2+時(shí)，底物鏈與酶鏈以及納米金表面修飾的DNA之間形成穩(wěn)定雜交，納米金顆粒團(tuán)聚，溶液顯示藍(lán)色。當(dāng)加入Pb2+后，底物鏈被切斷， 抑制了納米金的團(tuán)聚，溶液顯紅色。該傳感器的檢出限為100 nmol/L，可用于油漆中Pb2+的檢測(cè)。然而該傳感器采用頭對(duì)尾的雜交方式會(huì)產(chǎn)生很大的空間位阻，因此需要復(fù)雜的加熱-冷卻過程。為了解決這個(gè)問題，該小組又采用了尾對(duì)尾的雜交方式， 降低了雜交產(chǎn)生的空間位阻， 并使反應(yīng)可以在室溫下進(jìn)行[30]（圖1B）。此外，他們又引入了一段可與切割后的底物鏈片段雜交的DNA序列， 用于促進(jìn)納米金的釋放，使得傳感器的響應(yīng)時(shí)間只需5 min[30]。由于上述DNA酶?jìng)鞲衅鞫夹枰獙NAzyme共價(jià)修飾在納米金表面，過程復(fù)雜、成本較高， 且耗時(shí)長(zhǎng)，因此該小組又基于DNA酶切割底物鏈可產(chǎn)生單鏈DNA，而單鏈DNA能保護(hù)納米金顆粒在較高鹽離子條件下不會(huì)團(tuán)聚，設(shè)計(jì)了一種非標(biāo)記的比色傳感器用于Pb2+和UO2+2的檢測(cè)[32]（圖1C）。與此同時(shí)，Wang研究組[33]也報(bào)道了類似的無標(biāo)記檢測(cè)Pb2+的比色型DNA酶?jìng)鞲衅?。除此之外，Lu研究組[34]還基于脫氧核酶的催化連接活性， 設(shè)計(jì)了一種比色型傳感器， 用于Cu2+的檢測(cè)，該傳感器的背景干擾小，靈敏度高。上述結(jié)果表明，標(biāo)記型傳感器需要較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行預(yù)處理和制備，但是當(dāng)制備好傳感器后更易endprint

圖1 DNA酶比色傳感器設(shè)計(jì)原理圖（A） 納米金以“頭對(duì)尾”的方式連接[29]；（B）納米金以“尾對(duì)尾”的方式連接[30]；（C）非標(biāo)記策略用于引發(fā)納米金的團(tuán)聚[32]

Fig.1 Schematic illustration of the DNAzyme based colormetric sensors. （A） Gold nanoparticles were aligned in a “head-to-tail” manner[29]； （B） Gold nanoparticles were aligned in a “tail-to-tail” manner[30]； （C） Label-free strategies of recognition-triggered aggregation state change of gold nanoparticles [32]于操作和檢測(cè)；而非標(biāo)記型傳感器的靈敏度更高，且無需長(zhǎng)時(shí)間制備、更加經(jīng)濟(jì)，然而在檢測(cè)過程中易受到離子強(qiáng)度及其它一些因素的影響。

2.2 基于脫氧核酶-納米金顆粒的熒光傳感器的研究

納米金顆粒除了可以作為信號(hào)報(bào)告基團(tuán)用于比色分析外，還可用于熒光檢測(cè)。人們利用納米金顆粒作為熒光猝滅劑， 發(fā)展了一系列DNA酶熒光傳感器[35～38]。Wang等[35]設(shè)計(jì)了一條底物鏈與酶鏈一體化的探針，并將該探針通過SAu鍵共

圖2 A 基于納米金作熒光猝滅劑的DNAzyme熒光傳感器[36]； B 基于熒光偏振技術(shù)的DNA酶生物傳感器原理示意圖[38]

Fig.2 （A） Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescent biosensors using gold nanoparticles as fluorescence superquencher[36] and （B） Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescence anisotropy assay[38]

價(jià)修飾于納米金顆粒表面。由于標(biāo)記在底物鏈末端的熒光團(tuán)會(huì)靠近納米金，故熒光被猝滅。當(dāng)加入Pb2+后， 底物鏈被切斷，標(biāo)記有熒光團(tuán)的部分底物片段游離出來，熒光得以恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)了Pb2+的定量檢測(cè)（圖2A）。此外，Malashikhina等[36]發(fā)展了一種DNA酶與納米金結(jié)合的熒光生物傳感器， 用于抗壞血酸的檢測(cè)。Yin等[37]基于熒光偏振的方法設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)金屬離子的DNA酶?jìng)鞲衅鳎▓D2B）。標(biāo)記有熒光團(tuán)的底物鏈與共價(jià)修飾在納米金上的酶鏈雜交，由于大分子在溶液中運(yùn)動(dòng)慢，故熒光各向異性值大。Pb2+存在時(shí)， 底物鏈被切割，標(biāo)有熒光團(tuán)的部分底物片段與納米金分離，導(dǎo)致熒光各向異性值變小。然而， 上述傳感器都僅限于體外生物分子的檢測(cè)，構(gòu)建可高靈敏和特異性檢測(cè)體內(nèi)生物分子的脫氧核酶生物傳感器已成為近年來研究的熱點(diǎn)。Lu課題組基于金納米顆粒高的熒光猝滅率構(gòu)建了一種可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)UO2+2的生物傳感器[38]。DNA酶鏈共價(jià)修飾于納米金表面，底物鏈兩端分別標(biāo)記有Cy3熒光團(tuán)和BHQ猝滅團(tuán)。當(dāng)酶鏈與底物鏈雜交后，由于雙重猝滅作用，Cy3的熒光被有效猝滅。當(dāng)加入U(xiǎn)O2+2后，UO2+2催化底物鏈的RNA水解，從而使標(biāo)記有熒光團(tuán)的部分底物片段游離出來，熒光得到恢復(fù)。該熒光納米探針經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)UO2+2的成像檢測(cè)。

2.3 納米金顆粒作為信號(hào)放大基團(tuán)在生物分析中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中，探針的一端只能標(biāo)記一個(gè)生物分子，

其靈敏度受到限制。而納米金具有比較大的比表面積，作為探針載體其表面可標(biāo)記多個(gè)生物分子，從而可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大[39～42]。

圖3 基于樹枝狀納米結(jié)構(gòu)引發(fā)的放大傳感策略用于Pb2+檢測(cè)原理示意圖[40]

Fig.3 Schematic of the amplified sensing strategy of DNA-Au dendrimer-based SERS biosensor for Pb2+ detection[40]

本研究組發(fā)展了一種基于樹枝狀納米結(jié)構(gòu)信號(hào)放大技術(shù)的新型SERS傳感器[39]（圖3）。其底物鏈和酶鏈通過10個(gè)聚

T堿基連接在一起，且底物鏈的末端標(biāo)記有巰基，可通過SAu鍵組裝在金電極表面。當(dāng)加入Pb2+后，底物鏈中RNA堿基被水解，使其被切割為兩部分，與酶鏈連接的部分底物序列從金電極表面脫落下來，而金電極表面剩余的底物片段可與納米金標(biāo)記的報(bào)告探針雜交，然后通過層層自組裝形成樹枝狀納米結(jié)構(gòu)，SERS信號(hào)得到顯著增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)Pb2+的高靈敏檢測(cè)。而Shen等[40]構(gòu)建了一種以DNA功能化納米金作為信號(hào)放大基團(tuán)的DNA酶電化學(xué)傳感器。標(biāo)記有巰基的DNA酶鏈?zhǔn)紫缺唤M裝在金電極表面，而報(bào)告DNA 探針標(biāo)記在納米金顆粒表面，底物鏈則分別與酶鏈和報(bào)告DNA探針雜交形成三明治結(jié)構(gòu)。由于電活性物質(zhì)六氨合釕可以嵌入報(bào)告DNA 探針中從而獲得較大的電流信號(hào)。Pb2+的加入使得底物鏈被切斷，導(dǎo)致標(biāo)記有報(bào)告DNA 探針的納米金顆粒從電極表面脫離，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)減小，由此可以放大檢測(cè)Pb2+，與不用納米金放大基團(tuán)相比，其靈敏度提高了5倍。

3 脫氧核酶-石墨烯復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

石墨烯（Graphene）是一種由碳原子通過sp2雜化構(gòu)成的單層蜂窩狀的平面薄膜，它可以折疊成零維的富勒烯，卷曲成一維的碳納米管或堆垛形成三維的石墨，因此石墨烯是構(gòu)成其它碳質(zhì)材料的基本結(jié)構(gòu)單元[43]。石墨烯具有比表面積大、機(jī)械強(qiáng)度高、導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性好且表面修飾方便等優(yōu)點(diǎn)， 因而受到了很多科研工作者的關(guān)注。氧化石墨烯（GO）是石墨烯的衍生物，由于其表面含有很多羧基、羥基和環(huán)氧基等含氧活性基團(tuán)，所以具有良好的水溶性和生物相容性。將石墨烯及其衍生物與脫氧核酶結(jié)合， 用于構(gòu)建高效的生物傳感器， 引起了科研人員的廣泛關(guān)注[44～49]。endprint

Wen等[44]利用氧化石墨烯對(duì)單雙鏈DNA的吸附能力不同， 設(shè)計(jì)了一種DNA酶熒光探針， 用于Pb2+檢測(cè)（圖4A）。不存在Pb2+時(shí)，由于雜交探針的剛性雙鏈結(jié)構(gòu)使其與氧化石墨烯之間的吸附力比較弱，所以底物鏈上標(biāo)記的熒光團(tuán)的熒光不能被猝滅； 加入Pb2+后，底物鏈中RNA堿基被水解，使其被切割為兩部分，此時(shí)標(biāo)記有染料的部分底物片段與酶鏈解鏈并游離出來。由于游離的底物片段與氧化石墨烯之間吸附能力強(qiáng)，因此染料的熒光被猝滅，從而實(shí)現(xiàn)了Pb2+的定量檢測(cè)。由于上述傳感器是猝滅型的DNA酶?jìng)鞲衅?，其檢測(cè)的靈敏度受到限制。為了提高傳感器的靈敏度，本研究組[45]基于氧化石墨烯對(duì)不同長(zhǎng)度的單鏈DNA具有不同的吸附能力， 設(shè)計(jì)了一種熒光增強(qiáng)型的DNA酶生物傳感器， 用于Pb2+的高靈敏檢測(cè)（圖4B）。由于底物鏈和酶鏈的雜交探針中含有一段單鏈DNA序列，故該探針可以吸附在GO上，并使底物鏈5′端標(biāo)記的熒光團(tuán)靠近GO，導(dǎo)致熒光被猝滅。Pb2+的加入使DNA酶的催化活性被激活，底物鏈被切割為兩段。標(biāo)記有熒光團(tuán)部分底物片段（5個(gè)堿基）與酶鏈解鏈。釋放出的酶鏈可繼續(xù)與未反應(yīng)的底物鏈雜交，同時(shí)誘發(fā)下一輪反應(yīng)。如此循環(huán)， 傳感體系中就含有很多標(biāo)記有熒光團(tuán)的短鏈DNA。加入GO后，由于短鏈DNA與GO的結(jié)合力弱，故熒光團(tuán)遠(yuǎn)離GO，其熒光不被猝滅。該傳感器的靈敏度高，其檢出限為300 pmol/L。此外，Yu等[46]基于氧化石墨烯可以增強(qiáng)熒光各向異性的策略發(fā)展了一種DNA酶?jìng)鞲衅?。上述傳感器雖然靈敏度比較高，但是底物鏈都需要標(biāo)記熒光團(tuán)，故合成復(fù)雜且成本較高?；诖?，Liu等[47]將核酸嵌入劑GelRed和氧化石墨烯結(jié)合構(gòu)建了一種非標(biāo)記的DNA酶熒光傳感器， 用于Cu2+的檢測(cè)。除了基于DNAzyme的催化作用檢測(cè)其輔助因子外，DNAzyme

Fig.4 （A） schematic illustration of graphene-DNAzyme-based fluorescent turn-off biosensors[44] and （B） schematic illustration of graphene-DNAzyme based fluorescent turn-on biosensors[45] 在基因治療中也顯示出巨大的潛力。Kim等[48]利用氧化石墨烯作為載體將標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM的DNA酶非共價(jià)吸附在石墨烯上， 并用于細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒（HCV）基因的檢測(cè)與沉默。

石墨烯除了可與RNA切割型脫氧核酶結(jié)合設(shè)計(jì)生物傳感器外，也可與G四聚體脫氧核酶結(jié)合設(shè)計(jì)一些生物傳感器[49～51]，從而進(jìn)一步拓寬可檢測(cè)靶分子的類型，豐富傳感器的設(shè)計(jì)模式。Luo等[50]將可識(shí)別目標(biāo)序列的探針DNA與G-四聚體序列整合到一條鏈上，沒有目標(biāo)物存在時(shí)，探針DNA通過π-π鍵的相互作用吸附在GO上，從而使G四聚體-魯米諾復(fù)合體靠近GO，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號(hào)很弱； 加入目標(biāo)DNA后，目標(biāo)DNA與探針DNA雜交形成雙鏈剛性結(jié)構(gòu)，從而遠(yuǎn)離GO， G四聚體-魯米諾復(fù)合體的化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，由此可以定量檢測(cè)目標(biāo)DNA。為了進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度，Yuan等[51]將功能化的石墨烯作為G四聚體-Hemin復(fù)合體的納米載體， 設(shè)計(jì)了一個(gè)可以放大檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)傳感器。

4 脫氧核酶-量子點(diǎn)復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

量子點(diǎn)（Quantum dots， QDs） 又稱為半導(dǎo)體納米晶，通常是由Ⅱ～Ⅵ或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的新型半導(dǎo)體納米材料， 直徑在2～10 nm，由于電子和空穴被量子限域，其連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)變成分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，故受激發(fā)后可以產(chǎn)生熒光。與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比，量子點(diǎn)具有激發(fā)譜帶寬、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、發(fā)光壽命長(zhǎng)、熒光量子產(chǎn)率高及光化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)良的光學(xué)特性[53～56]，并成為化學(xué)與生物傳感領(lǐng)域中很有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N熒光納米材料。目前，研究人員將脫氧核酶與量子點(diǎn)結(jié)合并在生物分析領(lǐng)域做了一系列工作[57～59]。Wu等[57]利用發(fā)光為530 nm和625 nm兩種量子點(diǎn)構(gòu)建了可同時(shí)檢測(cè)Pb2+與Cu2+的DNA酶熒光傳感器（圖5A）。具體檢測(cè)原理是標(biāo)記有猝滅團(tuán)的底物鏈共價(jià)修飾到量子點(diǎn)表面，而同樣標(biāo)記有猝滅團(tuán)的DNA酶則與底物鏈雜交，由于量子點(diǎn)與猝滅團(tuán)靠近， 發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移， 導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光被猝滅。當(dāng)加入目標(biāo)物后，DNA酶的催化活性被激活， 并將底物鏈上RNA堿基水解，使其被切割為兩部分，故猝滅團(tuán)遠(yuǎn)離量子點(diǎn)，量子點(diǎn)的熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了Pb2+與Cu2+的同時(shí)檢測(cè)。與傳統(tǒng)的熒光染料相比，靈敏度分別提高了50倍和70倍。Sharon等[58]則基于G-四聚體脫氧核酶與血紅素結(jié)合后可以通過電荷轉(zhuǎn)移猝滅CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光， 設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)DNA和腺苷的熒光傳感器（圖5B）。

圖5 基于脫氧核酶與量子點(diǎn)結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖[57，58，60]

Fig.5 Schematic illustration of DNAzyme-quantum dots-based biosensors[57，58，60]

除了可以利用量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)設(shè)計(jì)生物傳感器外， 也可以利用其電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)多種目標(biāo)物[60～62]。 Zhang等[60]利用標(biāo)記有鏈霉親和素的PbS量子點(diǎn)與DNA酶結(jié)合， 構(gòu)建了一種高靈敏的電化學(xué)生物傳感器（圖5C）。Pb2+的存在激活了DNA酶的活性，故底物鏈被切割為兩段并游離出來。游離出來的標(biāo)記有生物素的底物鏈片段可與組裝在金電極表面的捕獲探針雜交，然后標(biāo)記有鏈霉親和素的PbS量子點(diǎn)通過親和素與生物素的特異性識(shí)別作用被固定在電極表面，最后通過電化學(xué)溶出法就可以測(cè)定Pb2+含量，其檢出限為0.6 nmol/L。Tang等[61]將量子點(diǎn)作為標(biāo)記物并利用滾環(huán)擴(kuò)增原理設(shè)計(jì)了一種可高靈敏檢測(cè)Pb2+的電化學(xué)型DNA酶?jìng)鞲衅?。此外，量子點(diǎn)還可以與脫氧核酶結(jié)合作為一個(gè)信號(hào)放大基團(tuán)用于其它物質(zhì)的檢測(cè)。如Zhang等[62]將PbS量子點(diǎn)標(biāo)記在二抗上，有目標(biāo)物AFP存在時(shí)，PbS量子點(diǎn)就可以通過夾心結(jié)構(gòu)固定在標(biāo)記有一抗的微孔板中。然后量子點(diǎn)中的Pb2+可以通過酸溶出法釋放出來，被釋放的Pb2+就可以激活組裝在電極表面的DNA酶的活性并使底物鏈被切割，導(dǎo)致標(biāo)記在酶鏈上的電化學(xué)活性物質(zhì)二茂鐵靠近電極并產(chǎn)生強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了AFP的高靈敏檢測(cè)。endprint

5 脫氧核酶-磁性納米顆粒復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

磁性納米材料是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型納米材料，由于其具有優(yōu)異的磁學(xué)性能、良好的生物相容性以及簡(jiǎn)單的表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、磁共振成像、細(xì)胞分離以及生物檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域[63～65]。磁性納米顆粒與脫氧核酶結(jié)合在生物傳感中也得到了廣泛應(yīng)用[66～71]。Nie等[66]基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法構(gòu)建了一種DNA酶生物傳感器， 用于Pb2+的檢測(cè)（圖6A）。其中GR-5DNAzyme的一端標(biāo)記有熒光團(tuán)，另一端則共價(jià)修飾于磁珠上，加入Pb2+后，兩端標(biāo)記有猝滅團(tuán)的底物鏈被切割并與酶鏈分離，致使傳感器的熒光恢復(fù)，由此可以定量檢測(cè)Pb2+。

使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法可以降低Pb2+檢測(cè)過程中光散射造成的干擾。Ge等[67]將捕獲探針共價(jià)修飾于磁珠上，Cu2+的存在使底物鏈被切割為兩段，其中的一段底物片段就可以作為催化劑引發(fā)兩條信號(hào)探針在磁珠上的自組裝，

圖6 基于脫氧核酶與磁性納米顆粒結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖[66，68]

Fig.6 Schematic illustration of DNAzyme-magnetic bead based biosensors[66，68]

最后通過SYBR Green Ⅰ嵌入核酸雙鏈實(shí)現(xiàn)Cu2+的無酶、無標(biāo)記熒光放大檢測(cè)。該傳感器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、花費(fèi)低廉且靈敏度高，其檢出限是12.8 pmol/L。除了利用RNA切割型脫氧核酶設(shè)計(jì)生物傳感器外，也可基于G四聚體脫氧核酶的信號(hào)放大作用設(shè)計(jì)一些高靈敏度的傳感器。Du等[68]在磁性納米顆粒上共價(jià)修飾了可卡因核酸適配體的一個(gè)片段，當(dāng)有可卡因存在時(shí)，與另外一條連接有G四聚體脫氧核酶的核酸適配體片段形成夾心復(fù)合物，然后通過磁性分離與脫氧核酶催化TMB顯色來比色檢測(cè)可卡因（圖6B）。Tang等[69]則依據(jù)上述夾心法原理并采用滾環(huán)放大策略擴(kuò)增G四聚體脫氧核酶片段最后實(shí)現(xiàn)PDGF的超靈敏檢測(cè)。磁性納米顆粒的磁性富集和分離功能可以有效的降低背景信號(hào)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè)，此外還可以減少實(shí)際樣品中非目標(biāo)物的干擾。

6 脫氧核酶-其它納米材料復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

脫氧核酶除了與上述幾種納米材料結(jié)合外，其它納米材料如水凝膠、樹枝狀DNA納米材料等也可以用來

圖7 基于脫氧核酶與水凝膠結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖 [73]

Fig.7 Schematic illustration of DNAzyme-hydrogel-based biosensors [73]

與DNA酶結(jié)合發(fā)展各種生物傳感器[72～74]。例如Lin等[72]利用DNA酶為水凝膠的交聯(lián)劑構(gòu)建了可檢測(cè)金屬離子的傳感平臺(tái)（圖7）。當(dāng)存在Cu2+時(shí)，水凝膠從凝膠狀態(tài)變?yōu)槿苣z狀態(tài)，此時(shí)包裹在凝膠中的納米金被釋放出來，因此可以根據(jù)納米金的釋放量來比色檢測(cè)Cu2+。本研究組[73]將DNA酶通過堿基互補(bǔ)組裝在DNA樹枝狀納米材料中，并構(gòu)建了生物相容性好、膜穿透能力強(qiáng)、高靈敏、高選擇性的熒光納米探針，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)組氨酸的成像檢測(cè)。

7 總結(jié)與展望

生命科學(xué)與納米材料是21世紀(jì)最前沿的兩大學(xué)科，納米材料的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮的空間。目前基于脫氧核酶和納米材料結(jié)合的生物傳感器已經(jīng)得到快速的發(fā)展，并深入到多個(gè)分析領(lǐng)域，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是要進(jìn)一步將其用于臨床和實(shí)際檢測(cè)，還有許多方面有待優(yōu)化。

首先，當(dāng)前大部分文獻(xiàn)報(bào)道的傳感器都僅限于在緩沖溶液中檢測(cè)，沒有真正應(yīng)用到實(shí)際樣品及生物體內(nèi)。事實(shí)上，在實(shí)際環(huán)境檢測(cè)和醫(yī)療診斷中其樣品成分非常復(fù)雜，故DNA酶?jìng)鞲衅髟趯?shí)際應(yīng)用中其性能容易受生物介質(zhì)的干擾。因此，可以考慮將DNA酶組裝在介孔納米材料的內(nèi)部，從而進(jìn)一步減少生物樣品分析中核酸酶等非目標(biāo)組分的干擾。其次，將DNA酶?jìng)鞲衅饔糜隗w內(nèi)生物分子檢測(cè)時(shí)，納米材料的生物安全性是需要考慮的問題。因此需要研發(fā)新型安全無毒的納米材料作為DNA酶的運(yùn)載體。DNA作為一種天然生物分子，具有良好的生物相容性，將DNA納米材料如四面體DNA和DNA納米花等作納米載體用于構(gòu)建DNA酶?jìng)鞲衅骺梢越档洼d體對(duì)細(xì)胞或組織的毒性，從而推進(jìn)傳感器真正應(yīng)用于臨床檢測(cè)。最后，目前用于傳感器設(shè)計(jì)的DNA酶主要是RNA切割型脫氧核酶與G四聚體脫氧核酶，其檢測(cè)目標(biāo)范圍有限。如果研究和篩選針對(duì)更多特定靶分子的脫氧核酶并將其用于傳感器的構(gòu)建，可以大大拓展脫氧核酶?jìng)鞲衅鞯倪m用范圍。隨著研究的不斷深入，脫氧核酶與納米材料結(jié)合的生物傳感器將被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)與食品安全等與生活息息相關(guān)的領(lǐng)域。

References

1 Eychmuller A. J. Phys. Chem. B， 2000， 104（28）： 6514-6528

2 Ball P，Garwin L. Nature， 1992， 355（6363）： 761-766

3 Cavucchi P E， Silsbee R H. Phys. Rev. Lett.， 1984， 52（16）： 1453-1456

4 Penn S G， He L， Natan M J. Curr. Opin. Chem. Biol.， 2003， 7（5）： 609-615

5 ZHANG Yu-Wei， XU Wei-Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（12）： 1932-1938

張玉微， 徐維林. 分析化學(xué)， 2013， 41（12）： 1932-1938

6 Singh A K， Flouders A W， Volponi J V， Ashley C S， Wally K， Schoeniger J S. Biosen. Bioelectron.， 1999， 14（8-9）： 703-713endprint

7 Bauer G， Pittner F， Schalkhammer T. Microchim. Acta， 1999， 131（1-2）： 107-114

8 Cuenoud B， Szostak J W. Nature， 1995， 375（15）： 611-614

9 Santoro S W， Joyce G F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1997， 94（9）： 4262-4266

10 ZHAO Yong-Xi， QI Lin， YANG Wei-Jun， WEI Shuai， WANG Ya-Ling. Chinese J. Anal.Chem.， 2012， 40（8）： 1236-1240

趙永席， 齊 林， 楊衛(wèi)軍， 魏 帥， 王亞玲. 分析化學(xué)， 2012， 40（8）： 1236-1240

11 Breaker R R. Nat. Biotechnol.， 1997， 15（5）： 427-431

12 Breaker R R， Joyce G F. Chem. Biol.， 1994， 1（4）： 223-229

13 Brown A K， Li J，Pavot C M B. Lu Y. Biochemistry， 2003， 42（23）： 7152-7161

14 Santoro S W， Joyce G F，Sakthivel K. J. Am. Chem. Soc.， 2000， 122（11）： 2433-2439

15 Carmi N， Balkhi H R， Breaker R R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1998， 95（5）： 2233-2237

16 Faulhammer D， Famulok M. Angew. Chem. Int. Ed.， 1996， 35（5）： 2837-2841

17 Gao L， Li L L， Wang X L， Wu P W， Cao Y， Liang B， Li X， Lin Y W， Lu Y， Guo X F. Chem. Sci.， 2015， 6： 2469-2473

18 Saadaoui M， Fernandez I， Sanchez A， Diez P， Campuzano S， Raouafi N， Pingarron J， Villalonga R. Electrochem. Commun. 2015， 58： 57-61

19 Yim T J， Liu J W， Lu Y， Kane R S， Dordick J S. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（35）： 12200-12201

20 Warashina M， Kuwabara T， Nakamatsu Y， Taira K. Chem. Biol， 1999， 6（4）： 237-250

21 Fan ， Zhao Z L， Yan G B， Zhang X B， Yang C， Meng H M， Chen Z， Liu H， Tan W H. Angew. Chem.Int. Edit， 2015， 127（16）： 4883-4887

22 Li J W， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2000， 122（42）： 10466-10467

23 Liu J W， Lu Y. Anal. Chem.， 2003， 75（23）： 6666-6672

24 Chiuman W， Li Y. Nuleic. Acids Res.， 2007， 35（2）： 401-405

25 Daniel M C， Astruc D. Chem. Rev.， 2003， 104（1）： 293-346

26 Zhang C， Zhang Z， Yu B， Shi J， Zhang X. Anal. Chem.， 2002， 74（1）： 96-99

27 Raj C R， Okajima T， Ohsaka T. J. Electroanal. Chem.， 2003， 543（2）： 127-133

28 Liu S Q， Ju H X. Biosens. Bioelectron.， 2003， 19（3）： 177-183

29 Liu J W， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（22）： 6642-6643

30 Liu J W， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（39）： 12298-12305

31 Liu J W， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（36）： 12677-12683

32 Lee J H， Wang Z D， Liu J W， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（43）： 14217-14226

33 Wei H， Li B L， Li J， Dong S J， Wang E K. Nanotechnology， 2008， 19（9）： 095501

34 Liu J W， Lu Y. Chem. Commun.， 2007， 46： 4872-4874

35 Wang H B， Wang L， Huang K J， Xu S P， Wang H Q. Wang L L， Liu Y M. New J. Chem.， 2013， 37（8）： 2557-2563endprint

36 Malashikhina N， Pavlov V. Biosens Bioelectron.， 2012， 33（1）： 241-246

37 Yin B C， Zuo P， Huo H， Zhong X H， Ye B C. Anal. Biochem.， 2010， 401（1）： 47-52

38 Wu P， Hwang K， Lan T， Lu Y. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（14）， 5254-5257

39 Sun Y H， Kong R M， Lu D Q， Zhang X B， Tan W H， Shen G L， Yu R Q. Chem. Commun.， 2011， 47： 3840-3842

40 Shen L， Chen Z， Li Y H， He S L， Xie S B， Xu X D， Liang Z W， Meng X， Li Q， Zhu Z W， Li M X， Le C， Shao Y H. Anal. Chem.， 2008， 80（16）： 6323-6328

41 Li L D， Chen Z B， Zhao H T， Guo L. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26（5）： 2781-2785

42 Pelossof G， Vered R T， Willner I. Anal. Chem.， 2012， 84（8）， 3703-3709

43 Geim A K， Novoselov K S. Nat. Mater.， 2007， 6（3）： 183-191

44 Wen Y Q， Peng C， Li D， Zhuo L， He S J， Wang L H， Huang Q， Xu Q H， Fan C H. Chem. Commun.， 2011， 47： 6278-6280

45 Zhao X H， Kong R M， Zhang X B， Meng H M， Liu W N， Tan W H， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.， 2011， 83（13）： 5062-5066

46 Yu Y， Liu Y， Zhen S J， Huang C Z. Chem. Commun.， 2013， 49： 1942-1944

47 Liu M， Zhao H M， Chen S， Yu H T， Zhang Y B， Quan X. Chem. Commun.， 2011， 47： 7749-7751

48 Kim S C， Ryoo S R， Na H K， Kim Y K， Choi B S， Lee Y H， Kim D E， Min D H. Chem. Commun.， 2013， 49： 8241-8243

59 Liu M， Zhao H M， Chen S， Yu H T， Zhang Y B， Quan X. Biosens Bioelectron.， 2011， 26（10）： 4111-4116

50 Luo M， Chen X， Zhou G H， Xiang X， Chen L， Ji X H， He Z K. Chem. Commun.， 2012， 48： 1126-1128

51 Yuan Y L， Liu G P， Yuan R， Chai Y Q， Gan X X， Bai L J. Biosens. Bioelectron.， 2013， 42（15）： 474-480

52 Xie S B， Chai Y Q， Yuan R， Bai L J， Yuan Y L， Wang Y. Anal. Chim. Acta， 2012， 755（28）： 46-53

53 Smith A M， Gao X H， Nie S M. Photochem. Photobiol.， 2004， 80（3）： 377-385

54 Bailey R E， Nie S M. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（23）： 7100-7106

55 Hines M A， Scholes G D. Adv. Mater.， 2003， 15（21）： 1842-1849

56 Jaiswal J K， Simon S M. Trends Cell Biol.， 2004， 14（9）： 497-504

57 Wu C S， Khaing O M K， Fan X D. ACS Nano.， 2010， 4（10）： 5897-5904

58 Sharon E， Freeman R，Willner I. Anal. Chem.， 2010， 82（17）： 7073-7077

69 Hu R， Liu T， Zhang X B， Yang Y H， Chen T， Wu C C， Liu Y， Zhu G Z， Huan S Y， Fu T， Tan W H. Anal. Chem.， 2015， 87 （15）： 7746-7753

60 Zhang H X， Jiang B Y， Xiang Y， Su J， Chai Y Q， Yuan R. Biosens. Bioelectron.， 2011， 28 （1）： 135-138

61 Tang S R， Tong P， Li H， Tang J， Zhang L. Biosens. Bioelectron.， 2013， 42： 608-611endprint

62 Zhang B， Liu B Q， Zhou J， Tang J， Tang D P. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2013， 5（10）： 4479-4485

63 Pankhurst Q A， Connolly J， Jones S K. Dobson J. J. Phys. D： Appl. Phys.， 2003， 36： 167-181

64 Gupta A K， Gupta M. Biomaterials， 2005， 26（18）： 3995-4021

65 Harisinghani M G， Barentsz J， Hahn P F. Deserno W M， Tabatabaei S， Kaa C H， Rosette J， Weissleder R. N Engl. J. Med.， 2003， 348： 2491-2499

66 Nie D D， Wu H Y， Zheng Q S， Guo L Q， Ye P R， Hao Y N， Fu F F， Guo Y H. Chem. Commun.， 2012， 48： 1150-1152

67 Ge C C， Chen J H， Wu W， Fang Z Y， Chen L B， Liu Q， Wang L， Xing X R， Zeng L W. Analyst， 2013， 138（17）： 4737-4740

68 Du Y， Li B L， Guo S J， Zhou Z X， Zhou M， Wang E K， Dong S J. Analyst， 2011， 136（3）： 493-497

69 Tang L H， Liu Y， Ali M M， Kang D K， Zhao W A， Li J H. Anal. Chem.， 2012， 84（11）： 4711-4717

70 Zhuang J Y， Fu L B， Xu M D， Zhou Q， Chen G N， Tang D P. Biosens. Bioelectron.， 2013， 45： 52-57

71 Bi S， Li L， Zhang S S. Anal. Chem.， 2010， 82（22）： 9447-9454

72 Lin H X， Zou Y， Huang Y S， Chen J， Zhang W Y， Zhuang Z X， Gareth J， Yang C Y. Chem. Commun.， 2011， 47： 9312-9314

73 Meng H M， Zhang X B， Lv Y F， Zhao Z L， Wang N N， Fu T， Fan H H， Liang H， Qiu L P， Zhu G Z， Tan W H. ACS Nano， 2014， 8（6）： 6171-6181

74 Chien M P， Thomposon M P， Gianneschi N C. Chem. Commun.， 2011， 47： 167-169endprint