基于競爭觸發(fā)滾環(huán)擴增的熒光適配體傳感器高靈敏檢測凝血酶

張松柏+鄭麗英+胡霞+沈廣宇++劉學文+沈國勵+俞汝勤

摘 要 利用目標蛋白、適體探針、掛鎖探針和與適體探針匹配的互補序列之間的競爭反應，發(fā)展了一種基于滾環(huán)擴增的高靈敏熒光適配體傳感器。在不含目標蛋白時，互補序列由于與適體探針雜交形成雙鏈，因此不能與掛鎖探針雜交以觸發(fā)連接-滾環(huán)放大反應。相反，有目標蛋白存在時，由于目標蛋白與適體探針結合，使得互補序列被置換下來，從而可以與掛鎖探針雜交。在DNA連接酶的作用下，掛鎖探針被進一步環(huán)化并在Phi 29 DNA聚合酶的作用下發(fā)生滾環(huán)擴增反應。擴增產(chǎn)物含有許多能與分子信標檢測探針環(huán)狀部分雜交的重復序列，從而分子信標被打開產(chǎn)生熒光信號。對互補序列的長度及掛鎖探針的濃度進行了考察。在優(yōu)化的實驗條件下，本傳感系統(tǒng)可以實現(xiàn)對的凝血酶高靈敏檢測，線性范圍為0.067～32 nmol/L，檢出限為0.03 nmol/L（約90 amol目標分子）。通過設計不同的適體探針和相關核酸序列，本傳感系統(tǒng)可以作為一種通用型方法用于其它目標物的分析。

關鍵詞 核酸適配體； 滾環(huán)擴增； 分子信標； 熒光； 凝血酶

1 引 言

臨床上對惡性腫瘤進行快速靈敏篩查常以腫瘤標志物作為檢測的目標分子。腫瘤標志物是一類由腫瘤組織和細胞產(chǎn)生的與腫瘤形成、發(fā)生相關的物質(zhì)，主要是腫瘤抗原、激素、酶及其同工酶等。例如凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白元變成纖維蛋白，促進血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在解釋腫瘤的發(fā)生機制及作為早期診斷、療效及預后判斷等方面均具有重要意義[1，2]。發(fā)展可以高靈敏檢測這些腫瘤標志物蛋白質(zhì)的生物傳感器是惡性腫瘤早期診斷的一個非常有效的方法。

近年來，核酸適配體技術的發(fā)展為腫瘤標志物蛋白質(zhì)的檢測提供了新的契機。核酸適配體是通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術在體外篩選得到的單鏈DNA或RNA寡核苷酸片段[3，4]，可高特異性結合蛋白質(zhì)、小分子，甚至細胞。核酸適配體作為一種新型分子識別元件，具有獨特的優(yōu)勢，如適體合成簡單、特異性強、穩(wěn)定性好、容易標記和修飾等， 被廣泛應用于蛋白質(zhì)分析、藥物篩選、疾病診斷、生物傳感器和分子識別元件的設計等方面。已報道的利用核酸適配體檢測蛋白質(zhì)的技術和方法包括比色法[5]、熒光法[6]、電化學法[7]等。相比于電化學方法需要多步的界面反應及繁瑣的操作，熒光法具有操作方便、響應快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但其檢測靈敏度低于電化學方法。因此，熒光適配體傳感器中常需要進行信號放大。

滾環(huán)擴增作為一種恒溫下進行的擴增反應，常用于蛋白質(zhì)分析的生物傳感方法[8]。本研究基于競爭觸發(fā)滾環(huán)擴增反應，利用適體探針、目標蛋白、互補序列和掛鎖探針之間的競爭反應發(fā)展了一種高靈敏檢測凝血酶的熒光適配體傳感方法。當樣品中含有待測目標分子凝血酶時，凝血酶與其適配體序列特異性結合形成獨特的空間三維結構，則互補序列只能與掛鎖探針雜交，并在E.coli DNA連接酶的作用下使掛鎖探針環(huán)化形成環(huán)狀DNA。進而在phi 29 DNA聚合酶的作用下進行滾環(huán)擴增，得到大量與掛鎖探針模板互補的長鏈DNA產(chǎn)物。使用分子信標作為信號探針與所得長鏈DNA進行雜交反應，分子信標熒光基團的熒光恢復，熒光強度大小與目標分子凝血酶的濃度相關，基于此建立了高靈敏檢測腫瘤標志物凝血酶的熒光適配體傳感器。此生物傳感系統(tǒng)的構建策略具有普適性，通過改變適配體探針的序列，可用于其它目標分子的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi F-2500 熒光分光光度計（日本Hitachi公司），150 W氙燈光源，檢測器為R928F紅敏光電倍增管。激發(fā)光和發(fā)射光狹縫寬度均為5.0 nm。激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長采集范圍為505～650 nm，其中520 nm處的熒光強度用于評價本檢測方法的分析性能。如無特殊說明，所有檢測均在室溫（20℃）下進行

實驗所用到的寡核苷酸序列均由生工生物（上海）有限公司合成，其序列如表1所示。核酸適配體探針的雙下劃線部分為凝血酶的核酸適配體，能與凝血酶特異性結合，也能與互補序列（CDNA）的一段序列（下劃線部分）互補。掛鎖探針的5′端進行了磷酸化，5′端和3′端下劃線且斜體部分能與CDNA完全互補。作為檢測探針的分子信標其5′端和3′端分別修飾了熒光基團FAM和猝滅基團DABCYL，斜體部分為莖干序列，黑體部分為與滾環(huán)擴增產(chǎn)物雜交的序列。

凝血酶購自上海源葉生物科技有限公司。E. coli DNA連接酶試劑盒（包括E. coli DNA連接酶，10×E. coli DNA連接酶反應緩沖液和10×BSA（0.5%））購自大連寶生物有限公司。Phi 29 DNA聚合酶購自Fermentas公司（包括10×Phi 29反應緩沖液）。其它化學試劑均為分析純，實驗中直接使用。實驗所用水均為3次蒸餾水，阻抗≥18 MΩ·cm。

2.2 連接反應

將凝血酶用儲存緩沖液稀釋，取不同濃度的凝血酶3 μL與等體積的適配體探針（60 nmol/L）混合，反應30 min；加入相同體積的互補序列CDNA（60 nmol/L）再反應30 min， 然后再加入90 nmol/L掛鎖探針3 μL與游離的CDNA進行雜交反應30 min。向所得反應液中相繼加入10×E. coli DNA連接酶反應緩沖液2 μL，10×BSA溶液2 μL 及1 U/μL E. coli DNA連接酶4 μL，37℃下溫育60 min進行連接反應，得到20 μL連接反應液。

2.3 滾環(huán)擴增及蛋白質(zhì)分析

向2.2節(jié)中所得到的20 μL連接反應液中相繼加入10×Phi 29反應緩沖液4 μL，dNTPs溶液（含A， T， G， C各10 mmol/L）4 μL，滅菌水10 μL，最后加入10 U/μL Phi29 DNA聚合酶2 μL，所得聚合反應液總體積為40 μL，其中4種dNTPs濃度均為1 mmol/L，Phi29 DNA聚合酶濃度為0.5 U/μL。將所得溶液于37℃溫育30 min進行滾環(huán)擴增反應。反應完成后將溶液在65℃水浴中加熱10 min，使Phi29 DNA聚合酶失活，終止擴增反應，然后將溶液冷卻至室溫。最后加入分子信標檢測探針溶液60 μL與滾環(huán)擴增產(chǎn)物反應30 min后，測量所得溶液的熒光光譜。endprint

3 結果與討論

3.1 傳感器構建原理

在典型的滾環(huán)擴增反應中，當有環(huán)狀DNA模板、引物和聚合酶時，通過DNA聚合酶的作用，以環(huán)形DNA為模板進行復制，引物被延伸并最終形成一條與環(huán)狀DNA模板互補的具有成千上萬重復序列的線狀單鏈DNA，由此可以實現(xiàn)對靶核酸的檢測信號的放大，該方法靈敏度高，理論上可以檢測到一個拷貝的核酸分子[9]。本實驗利用滾環(huán)擴增的原理，設計了一種利用核酸適配體競爭反應觸發(fā)滾環(huán)放大檢測蛋白質(zhì)的新方法。本方法的關鍵在于競爭反應相關核酸序列的設計。本研究通過專業(yè)的DNA分析軟件mfold設計各核酸的序列，使適體探針的3′端包含15個堿基的凝血酶的適配體序列?；パaDNA序列（CDNA）既能與適體探針的一段互補也能與掛鎖探針的5′和3′端互補。當樣品中沒有目標蛋白時，CDNA與適體探針互補雜交形成穩(wěn)定的雙鏈DNA，因此掛鎖探針不能與CDNA雜交，無法成環(huán)和擴增。相反，在有目標蛋白存在的條件下，由于目標蛋白與適體探針高特異性結合，使得CDNA不能與適體探針雜交，未反應的CDNA則能與掛鎖探針的5′和3′端雜交。在大腸桿菌DNA連接酶的作用下，掛鎖探針5′和3′端連接成環(huán)。形成的環(huán)狀掛鎖探針以CDNA作為引物在Phi29 DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增反應，得到如圖1所示長鏈單鏈DNA擴增產(chǎn)物。該擴增產(chǎn)物含有成千上萬與環(huán)狀掛鎖探針互補的重復序列，而每段重復序列又包含能與分子信標檢測探針環(huán)狀部分互補的序列，

分子信標與其雜交反應后，發(fā)夾結構被打開，熒光基團信號得以恢復，其熒光強度大小與目標蛋白含量相關，基于此構建了可以對超微量樣品中的目標蛋白快速靈敏檢測的熒光適配體傳感器。該傳感方法將適體與蛋白質(zhì)的特異反應轉化為相應核酸的擴增反應，從而實現(xiàn)目標蛋白的信號放大和靈敏檢測，檢測速度快，操作簡單易行。通過改變適體探針、掛鎖探針和CDNA的序列，還可以將該方法應用于其它目標分子的檢測，具有通用性。

3.2 CDNA序列的考察

本研究采用的基于滾環(huán)擴增的熒光適配體傳感方法包含兩組反應，即目標蛋白和CDNA均能與適體探針反應，而適體探針和掛鎖探針又競爭結合CDNA，其中CDNA同時參與了兩組反應，其序列的長短直接影響兩組反應的程度，因此實驗中考察了不同長度的CDNA序列對傳感器響應性能的影響。設計了4條不同長度的CDNA，序列如表1所示。其下劃線部分能與適體探針互補雜交，5′端和3′端分別延伸不同數(shù)量的T堿基以依次增加CDNA和掛鎖探針雜交的堿基對數(shù)。將此4條不同長度的CDNA分別按照實驗部分的步驟構建熒光適配體傳感器，考察傳感器在有無目標蛋白時的熒光響應，結果如圖2所示。

圖2A中4條曲線從下往上依次為使用CDNA1， CDNA2， CDNA3和CDNA4構建的適配體傳感器對32.4 nmol/L凝血酶的熒光響應?？梢姡珻DNA1引起的熒光響應相對較小，這可能是CDNA1序列較短，與掛鎖探針雜交不夠穩(wěn)定所致；而當CDNA序列延長后，傳感器熒光響應急劇升高（如CDNA2）；但繼續(xù)延長序列，熒光升高不夠明顯（如CDNA3和CDNA4），這可能是因為CDNA序列延伸到一定長度后，已經(jīng)可以與掛鎖探針穩(wěn)定雜交，繼續(xù)延長序列對其穩(wěn)定性影響較小。

圖2B圖中4條曲線從下往上依次對應使用CDNA1， CDNA2， CDNA3和CDNA4構建的適配體傳感器對空白樣品的熒光響應?？梢姡瑢τ诳瞻讟悠?，CDNA1和CDNA2引起的熒光響應均很小，說明當待測樣品中沒有目標蛋白時，適體探針仍然與CDNA穩(wěn)定雜交，導致CDNA沒有與掛鎖探針反應，進而沒有后續(xù)的滾環(huán)擴增反應發(fā)生。這可能是因為CDNA1和CDNA2與適體探針雜交后，掛鎖探針與適體探針競爭時不足以將CDNA競爭置換下來。而當CDNA的序列延長到一定程度后，例如CDNA3和CDNA4，其與掛鎖探針的雜交穩(wěn)定性要高于與適體探針雜交的穩(wěn)定性，從而即使沒有目標蛋白存在，掛鎖探針也可將部分CDNA競爭置換下來，引發(fā)后續(xù)的滾環(huán)擴增反應，進而與檢測探針反應后可以檢測到較強的熒光。

圖2 使用不同長度序列CDNA所構建傳感器對相同濃度（32.4 nmol/L）的目標蛋白（A圖）和空白樣品（B圖）的熒光響應（從下往上依次對應使用CDNA1、CDNA2、CDNA3和CDNA4所構建傳感器的熒光響應）以及其熒光強度（C圖，黑色柱代表凝血酶樣品，灰色柱代表空白樣品）和相對熒光強度（D圖）的直接比較。

將圖2A和圖2B中不同CDNA構建的傳感系統(tǒng)對有無目標分子的熒光響應進行直接對比，發(fā)現(xiàn)隨著互補探針序列的增長，傳感系統(tǒng)的熒光響應也均呈增加趨勢，如圖2C圖所示。對比發(fā)現(xiàn)CDNA1和CDNA2在有無目標分子時其熒光強度有較大的差值（相對熒光強度），而CDNA3和CDNA4的相對熒光強度較小，其中采用CDNA2時的信噪比最大。因此，后續(xù)實驗中均使用CDNA2用于構建本傳感系統(tǒng)。

3.3 掛鎖探針濃度的考察

掛鎖探針與適體探針競爭結合CDNA，其濃度對競爭反應有一定的影響。實驗考察了掛鎖探針與CDNA濃度在不同的比例關系下傳感系統(tǒng)的熒光響應，結果如圖3所示。隨著掛鎖探針和CDNA摩爾濃度比增大，傳感器熒光響應也相應地增加，在比例關系為3∶2時有最大的熒光響應。比例關系繼續(xù)增加，系統(tǒng)熒光響應反而降低。這可能是因為掛鎖探針超過一定濃度后，其濃度越大，越容易導致CDNA的兩端分別連接一分子掛鎖探針。這種情況下掛鎖探針不能被環(huán)化，因而也不能發(fā)生后續(xù)的滾環(huán)擴增反應。因此，為了獲得最佳檢測性能，實驗中選擇掛鎖探針與CDNA的摩爾濃度之比為3∶2。

3.4 傳感器分析性能

本研究利用滾環(huán)擴增的基本原理結合核酸適配體對目標蛋白的特異性識別發(fā)展了一種有效的熒光適配體傳感方法，將適體探針對目標蛋白的識別轉化為核酸的擴增從而實現(xiàn)信號放大，理論上可以實現(xiàn)對單分子目標蛋白的檢測。傳感器對不同濃度的凝血酶溶液的熒光響應如圖4所示。圖4A為此熒光適配體傳感器對不同樣品溶液的熒光響應曲線。隨著凝血酶濃度的增大，熒光信號逐漸增強。在0.067 ～32.4 nmol/L的范圍內(nèi)，520 nm處熒光峰強度與目標分子凝血酶濃度的對數(shù)呈線性關系，線性方程為F=396.5lgC+625.1，相關系數(shù)為0.9934，以3倍信噪比計算其檢出限為0.03 nmol/L。endprint

圖4 傳感器對空白樣品和不同濃度（從a到h： 0.067 nmol/L， 0.2 nmol/L， 0.6 nmol/L， 1.8 nmol/L， 5.4 nmol/L， 16.2 nmol/L和32.4 nmol/L）凝血酶的熒光響應（A圖）以及傳感器的線性相關曲線（B圖）。

Fig.4 （A） Fluorescence response of the sensor to blank sample and thrombin with different concentrations （0.067 nmol/L， 0.2 nmol/L， 0.6 nmol/L， 1.8 nmol/L， 5.4 nmol/L， 16.2 nmol/L and 32.4 nmol/L）； （B） Linear regression curve of the proposed biosensor

與文獻報道的檢測凝血酶的適配體傳感器相比，本研究提出的基于競爭觸發(fā)滾環(huán)擴增的熒光適配體傳感方法其檢測靈敏度要高于大多數(shù)光學[10，11]和電化學[12，13]檢測方法，可與一些應用了其它信號放大方法的適體傳感方法相媲美。例如，Giusto等[14]基于鄰近延伸信號放大發(fā)展的熒光適配體傳感器對凝血酶的檢出限為30 pmol/L，Deng等[15]利用金納米顆粒信號放大發(fā)展的阻抗型適體傳感器對凝血酶檢出限達20 pmol/L。但由于本實驗中凝血酶樣品的用量僅為3 μL，換算成摩爾量后僅為90 amol，遠低于其它信號放大方法的實際用量。而且，本方法很容易通過修改適體探針及其對應的CDNA和掛鎖探針的序列實現(xiàn)對其它目標分子的檢測，具有普適性，在腫瘤標志物蛋白或小分子等檢測領域具有潛在的應用價值。

3.5 特異性和重現(xiàn)性

本方法的選擇性主要取決于傳感系統(tǒng)的特異性。如圖5所示，32.4 nmol/L凝血酶（約1 μg/mL）引起的傳感器熒光響應約為1220 a.u.，而1 mg/mL IgG、10 mg/mL anti-IgG和10 mg/mL BSA引起的熒光響應非常小，接近分子信標的背景熒光，表明本傳感系統(tǒng)具有良好的選擇性，這主要是由核酸適配體對其對應目標分子的高親和力、高特異性識別。

考察了傳感器的重現(xiàn)性。實驗中對線性范圍內(nèi)不同濃度（0.2， 0.6和5.4 nmol/L）的凝血酶樣品進行3次平行實驗，相對標準偏差為2.1%～5.7%，表明本傳感系統(tǒng)對凝血酶的檢測具有較好的重現(xiàn)性。

3.6 回收率測定

為考察所構建傳感器的實用性，在稀釋10倍的人血清樣品中進行了凝血酶的回收率測定，結果見表2。平均回收率為98.8%，說明通過本檢測方案構建的傳感系統(tǒng)可用于血液樣品中凝血酶的測定。

圖5 傳感器特異性考察。32.4 nmol/L凝血酶、1 mg/mL IgG、10 mg/mL anti-IgG和10 mg/mL BSA。

Fig.5 Specificity of the sensor. Conditions： 32.4 nmol/L thrombin， 1 mg/mL IgG， 10 mg/mL anti-IgG and 10 mg/mL BSA.

4 結 論

建立了一種利用競爭反應觸發(fā)連接和滾環(huán)放大以檢測凝血酶的熒光適配體傳感方法。使用背景熒光低的分子信標作檢測探針，此方法對模型目標蛋白凝血酶可實現(xiàn)高靈敏檢測，檢出限可低至0.03 nmol/L。通過設計不同的適體探針、CDNA及掛鎖探針，可實現(xiàn)對不同目標蛋白質(zhì)的檢測，具有普適性。

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