陳志磊　安鳳楊　劉笑宇　劉歡　郭云然　于海琦

[摘要]目的：分析與探討燃煤型砷中毒患者中抑癌基因p1 6突變與甲基化的情況及意義。方法：選取120例2013年4月-2015年5月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，依照皮膚病變病理學(xué)診斷結(jié)果，將所有患者分為癌前組（24例）、癌病組（20例）及普通病變組（76例），通過(guò)PCR與PCR-SSCP產(chǎn)物克隆測(cè)序檢測(cè)突變熱點(diǎn)顯子，并通過(guò)甲基化內(nèi)切酶分析第1外顯子。結(jié)果：通過(guò)PCR與PCR-SSCR產(chǎn)物克隆測(cè)序?qū)θ济盒蜕橹卸静∪送庵苎狣NA進(jìn)行分析，沒(méi)有檢測(cè)出抗癌基因p16第2外顯子發(fā)生突變。通過(guò)SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌變組患者中，擴(kuò)增出抗癌基因p16第1外顯子片段4例，普通病變組與癌前組患者沒(méi)有檢測(cè)出SmaI位點(diǎn)甲基化情況。結(jié)論：研究表明，p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性腫瘤中失活的關(guān)鍵方式，而且在砷致癌中發(fā)揮著重要作用。

[關(guān)鍵詞]抑癌基因p16；燃煤型砷中毒；突變；甲基化

1資料與方法

1.1一般資料

選取120例2013年4月-2015年5月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，其中92例男性，28例女性，年齡為19-60歲，平均年齡為（47.2±4.5）歲。依照皮膚病變病理學(xué)診斷結(jié)果，將所有患者分為癌前組（24例）、癌病組（20例）及普通病變組（76例）。三組患者臨床資料差異性不明顯，P>0.05，不具有可比性。

1.2儀器與試劑

所用試劑為dNTP、Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶SmaI以及電泳用瓊脂糖，以上試劑均為上海TaKaRa公司提供。所選儀器為全自動(dòng)紫外分光光度計(jì)、電泳儀等。

1.3提取DNA

空腹采取患者2ml靜脈血，并行EDTAK2抗凝，采用酚氯仿法對(duì)基因組患者DNA進(jìn)行抽提，紫外分光光度計(jì)實(shí)施定量，將其稀釋到大約100ng/ul，在-20℃環(huán)境下保存。

1.4 PCR-SSCP

通常p16基因點(diǎn)在第2外顯子發(fā)生，而且由于第2外顯子相對(duì)比較大，通過(guò)兩對(duì)引物實(shí)施擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定后，去PCR產(chǎn)物5ul，再加入SSCP緩沖液（5u1）混勻。

1.5甲基化分析

通過(guò)內(nèi)切酶Sinai實(shí)施DNA酶切，并在30～C環(huán)境下進(jìn)行16h的消化，65℃環(huán)境下滅活大約20mm，將消化完成的DNA當(dāng)作模板，并對(duì)p16基因第一外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，CG甲基化將這種酶切作用阻斷，若DNA通過(guò)SmaI消化后依舊可以向第一外顯子擴(kuò)增，表示這種基因SmaI位點(diǎn)甲基化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，）（2檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異性比較明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1抗癌基因p16第2外顯子突變檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR與PCR-SSCR產(chǎn)物克隆測(cè)序?qū)θ济盒蜕橹卸静∪送庵苎狣NA進(jìn)行分析，沒(méi)有檢測(cè)出抗癌基因p16第2外顯子發(fā)生突變。

2.2分析抗癌基因p16第1外顯子甲基化結(jié)果

通過(guò)SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌變組患者中，擴(kuò)增出抗癌基因p16第1外顯子片段4例，普通病變組與癌前組患者沒(méi)有檢測(cè)出SmaI位點(diǎn)甲基化情況，見(jiàn)表1。

3討論

抑癌基因p16是近年來(lái)所研制的一種在細(xì)胞分裂中直接作用的一種基因，抑癌基因p16主要參與腫瘤病變發(fā)生及發(fā)展，其中的抑制細(xì)胞p16和視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因、p53基因、細(xì)胞周期素依賴(lài)性集美以及細(xì)胞周期素等組成周期細(xì)胞反饋調(diào)節(jié)環(huán)，對(duì)人體細(xì)胞周期具有調(diào)控作用。本研究通過(guò)PCR、PCR-SSCP產(chǎn)物克隆測(cè)序檢測(cè)突變熱點(diǎn)顯子，沒(méi)有檢測(cè)出突變現(xiàn)象。并通過(guò)甲基化內(nèi)切酶分析第1外顯子，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌變組患者中，擴(kuò)增出抗癌基因p16第1外顯子片段4例，普通病變組與癌前組患者沒(méi)有檢測(cè)出SmaI位點(diǎn)甲基化情況。砷是一種致癌物質(zhì)，在生物機(jī)體與外在環(huán)境中均存在甲基化代謝轉(zhuǎn)換過(guò)程，采用甲基化的方式降低砷的毒性，然而，因?yàn)樯檗D(zhuǎn)化途徑類(lèi)似于DNA甲基化，很可能會(huì)導(dǎo)致抑癌基因或者原癌基因甲基化模式發(fā)生變化，具有致癌作用，而p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性腫瘤中失活的關(guān)鍵方式，而且在砷致癌中發(fā)揮著重要作用。