韓銳?李林格?段玲?夏燕?陳俞

[摘要] 目的 使用兩種不同的檢測(cè)方法對(duì)71例非綜合征型耳聾患者進(jìn)行耳聾基因的檢測(cè)，為臨床提供更多有意義的突變篩查位點(diǎn)，提高耳聾致病基因的檢出率。 方法 收集自2014年7月～2015年12月的71例中重度感應(yīng)性神經(jīng)性耳聾患者，使用芯片雜交和多重?zé)晒釶CR兩種不同的方法對(duì)71例非綜合征型耳聾患者進(jìn)行耳聾基因的檢測(cè)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 兩種方法對(duì)71例非綜合征型耳聾患者耳聾基因的篩查率存在顯著差異（P<0.05）。芯片雜交法對(duì)71例患者致聾基因檢出率為14.08%（10/71），多重?zé)晒釶CR方法對(duì)71例患者致聾基因的檢出率為30.98%（22/71）。兩種方法檢測(cè)的耳聾基因致病突變位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢出率的顯著差異。 結(jié)論 與芯片檢測(cè)方法相比多重?zé)晒釶CR方法中增加的檢測(cè)位點(diǎn)，對(duì)于提高臨床耳聾致病基因的篩查率是有意義的。

[關(guān)鍵詞] 耳聾；基因；突變；檢出率

[中圖分類號(hào)] R764.43 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）20-07-05

Contrast analysis of test results of two kinds of detection methods in 71 cases of non-syndromic deafness patients

HAN Rui1 LI linge2 DUAN Ling1 XIA Yan1 CHEN Yu2

1. Prenatal Diagnosis Center， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China；

2. Department of E.N.T. ， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

[Abstract] Objective Using two different of methods to test 71 cases of non-syndromic deafness patients about the deafness gene， to provide more meaningful screening for clinic， to improve the deafness gene detection rate. Methods 71 cases of non-syndromic deafness patients from July 2014 to December 2015 were selectrd as the study objects. Chip hybridization and multiple fluorescent PCR two different methods were used to test the 71 cases of non-comprehensive deafness patients about deafness gene， and SPSS17.0 software was used for the data analysis. Results There were significant diffience between the two kinds of methods for 71 cases of non-syndromic deafness patients （P<0.05）. The deafness gene detection rate of chip hybridization method was 14.08% （10/71） ， and the deafness gene detection rate of multiple fluorescent polymerase chain reaction （PCR） method was 30.98 （22/71） . Deafness gene's mutation site of the two methods was different， which led to a significant difference in detection rate. Conclusion Compared with chip detection method ， increasing testing site in multiple fluorescent polymerase chain reaction （ PCR ） is meaningful for improving the clinical deafness gene screening rate .

[Key words] Deafness； Genes； Mutation； Detection rate

耳聾（HL）是人類最常見(jiàn)的致殘?jiān)蛑?，?yán)重影響了人類的生活質(zhì)量。造成耳聾的原因有很多，創(chuàng)傷和藥物或遺傳和環(huán)境因素共同作用都會(huì)導(dǎo)致耳聾的發(fā)生[1-2]。全球新生兒耳聾的發(fā)病率約為1/1000，50%以上的耳聾是由于遺傳因素導(dǎo)致的[2-3]。在遺傳性耳聾中，大約有70%的患者除耳聾外不伴有其他癥狀，稱為非綜合征型聾，其余30%是伴有其他器官或功能異常的耳聾，稱為綜合征型耳聾[4]。

目前臨床上針對(duì)非綜合征型耳聾患者耳聾基因突變的檢出率低于50%。許多我們暫時(shí)無(wú)法檢出的少見(jiàn)突變導(dǎo)致的非綜合征型耳聾，增加了臨床病因診斷的難度。

非綜合征型耳聾基因定位已超過(guò)177個(gè)基因座，涉及100多個(gè)基因的1000多個(gè)突變位點(diǎn)（http：// hereditaryhearingloss.org/，updated in June 2016）。非綜合征型耳聾涉及的基因較多，從臨床篩查實(shí)用性以及檢測(cè)結(jié)果時(shí)效性的角度出發(fā)，我們無(wú)法將所有已知的耳聾基因都進(jìn)行檢測(cè)，因此我們就需要選擇覆蓋人群范圍更多，突變頻率更高的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。大量研究表明，雖然耳聾基因具有較高的基因和位點(diǎn)異質(zhì)性，但大部分非綜合征性耳聾多由少數(shù)幾個(gè)熱點(diǎn)基因突變引起，包括GJB2基因、SLC26A4基因和線粒體12S rRNA基因等，這使得遺傳性耳聾的篩查成為可能[5-8]。

本研究選取71例非綜合癥型耳聾患者，采用了兩種不同的檢測(cè)方法對(duì)耳聾患者進(jìn)行了耳聾基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)，方法一：采用了博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?HybSetTM基因微陣列芯法，該芯片檢測(cè)了GJB2、SLC26A4和12S rRNA3個(gè)耳聾基因的8個(gè)突變位點(diǎn)。方法二：使用天昊生物有限公司的AccuCopy多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)檢測(cè)了GJB2、SLC26A4和12S rRNA3個(gè)耳聾基因的124個(gè)突變位點(diǎn)。比較兩種方法對(duì)臨床耳聾基因檢測(cè)的差異和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集了自2014年7月～2015年12月之間的71例中重度感應(yīng)性神經(jīng)性耳聾患者。其中25例是來(lái)自新疆維吾爾自治區(qū)喀什市殘聯(lián)的維吾爾族患者，其余46例是新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診的散發(fā)漢族患者。通過(guò)填寫調(diào)查問(wèn)卷和詢問(wèn)病史的方式掌握課題參與者的病史及家族史資料，并建立詳實(shí)的病例檔案。病例內(nèi)容包括患者基本信息、耳聾病史、家族史、聾兒出生史、用藥史、個(gè)人史等。所有參與課題研究的患者都進(jìn)行耳鼻喉?？茩z查、純音聽(tīng)閾測(cè)試。對(duì)耳聾的分級(jí)為：聽(tīng)力正常<20dB nHL；輕度聽(tīng)力損失21～40dB nHL；中度聽(tīng)力損失41～70dB nHL；重度聽(tīng)力損失71～95dB nHL；完全聽(tīng)力損失>95dB nHL，測(cè)聽(tīng)頻率分別為0.5、1、2、和4kHz[9]。所有的患者都是散發(fā)并且無(wú)血緣關(guān)系，否認(rèn)環(huán)境和外傷因素所致的耳聾，聽(tīng)力檢測(cè)表現(xiàn)為中重度以上感音神經(jīng)性聾，認(rèn)定耳聾患者為非綜合征型聾。每一個(gè)先證者和他們的家庭成員，都簽署了參與此項(xiàng)研究的知情同意書，此項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院人文倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

對(duì)被檢測(cè)者抽取外周靜脈血3～5mL， 采用“天根生化DP319”全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA，步驟參照試劑盒提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。

方法一：采用帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點(diǎn)特異性引物對(duì)基因組DNA相關(guān)基因位點(diǎn)所在的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，然后與能夠識(shí)別相應(yīng)標(biāo)簽序列的通用基因芯片進(jìn)行雜交。使用晶芯?HybSetTM基因微陣列芯片掃描儀和相應(yīng)的遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12 SrRNA基因突變的檢測(cè)，操作按博奧生物有限公司生產(chǎn)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

方法二：使用天昊生物有限公司的AccuCopy多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)對(duì)受試者基因組DNA進(jìn)行耳聾基因的檢測(cè)。按照天昊生物提供的SNPscan耳聾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作流程，完成71位受試者基因組DNA的連接反應(yīng)、多重?zé)晒釶CR、PCR產(chǎn)物上機(jī)（ABI3130XL）測(cè)序過(guò)程，獲得71位受試者的測(cè)序結(jié)果，測(cè)序的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0 （美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司） 分析，最終得到71位受試者GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12 SrRNA基因突變位點(diǎn)的結(jié)果。所有的候選突變都通過(guò)Sanger測(cè)序證實(shí)，利用患者和家庭成員之間的樣品分離分析鑒定致病性的突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種篩查方法耳聾基因的檢出率

本研究分別用兩種耳聾基因篩查方法對(duì)71例患者進(jìn)行了耳聾基因的檢測(cè)。每種方法的檢出率如表1所示。71例耳聾患者博奧芯片的耳聾基因檢出率為14.08%（10/71），天昊生物的耳聾基因檢出率為30.98%（22/71）。

2.2 兩種篩查方法檢測(cè)出的突變位點(diǎn)

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法對(duì)71例非綜合癥型耳聾患者直接致聾基因突變的檢出率存在明顯差異（P<0.05）。方法一檢測(cè)了GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12S rRNA基因中8個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)，檢出率為14.08%（10/71）。使用方法二對(duì)71例樣本重新進(jìn)檢測(cè)，檢測(cè)了GJB2基因、SLC26A4基因以及12S rRNA基因中124個(gè)突變位點(diǎn)，檢出率為30.98%（22/71）。方法二與方法一比較，對(duì)公認(rèn)的突變異質(zhì)性較高的SLC26A4基因增加了75個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)GJB2基因增加了27個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)。22例檢出明確耳聾致病突變的病例數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

3 討論

遺傳性耳聾具有較高的遺傳異質(zhì)性。截止到2016年6月，有110個(gè)致病基因被克隆，包括DFNA相關(guān)基因34個(gè)，DFNB相關(guān)基因69個(gè)，DFN相關(guān)基因4個(gè)，線粒體相關(guān)基因2個(gè)；共包含突變2000余種（http：//hereditaryhearing loss.）[10]。引起遺傳性耳聾的基因按功能分為影響離子動(dòng)態(tài)平衡、毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)、蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)節(jié)和線粒體功能等。鑒定遺傳性耳聾相關(guān)基因?qū)Ψ治鰞?nèi)耳的不同分子通路和功能結(jié)構(gòu)非常有幫助。除去遺傳學(xué)上的異質(zhì)性，由于基因突變位置和類型的不同，同一基因在表達(dá)上也有一定的差異，例如感音神經(jīng)性耳聾基因能夠產(chǎn)生顯性或隱性的表型。上述現(xiàn)象的存在，使得遺傳性耳聾的基因診斷非常困難。盡管如此，GJB2、SLC26A4和12S rRNA這三個(gè)基因及其突變?cè)谶z傳性耳聾發(fā)病中起到至關(guān)重要的作用，常作為耳聾基因診斷的首選。GJB2基因突變?cè)谑澜缍鄶?shù)人群中與50%以上的中度至極重度先天性聾相關(guān)[11-13]；SLC26A4基因突變與4.6%～12.4%的重度以上先天性聾相關(guān)[14]，在亞洲SLC26A4基因突變中，80%的患者存在前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大和耳蝸Mondini畸形[15-17]；12S rRNA基因與0.6%～8.5%應(yīng)用氨基糖甙類類抗生素致聾相關(guān)。針對(duì)上述三個(gè)致聾基因進(jìn)行檢測(cè)，可以最大程度上提高致聾基因的檢出率。因此我們?cè)诜椒?中選擇對(duì)這三個(gè)致聾基因進(jìn)行更多突變位點(diǎn)的檢測(cè)，提高遺傳性聾的基因突變檢出率。

本次研究中使用了兩種不同的檢測(cè)方法對(duì)71例雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾患者進(jìn)行耳聾基因突變的檢測(cè)，兩種方法的基因突變檢出率存在顯著差異（P<0.05）。方法一的耳聾基因致病突變檢出率為14.08% （10/71），方法二的耳聾基因致病突變檢出率為30.98%（22/71）。兩種檢測(cè)方法收費(fèi)一樣，但是檢出率存在顯著差異。針對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為，耳聾基因篩查方法應(yīng)該選擇費(fèi)用更低，檢出率更高，更經(jīng)濟(jì)有效的方法進(jìn)行。方法二與方法一比較，對(duì)公認(rèn)的突變異質(zhì)性較高的SLC26A4基因增加了75個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)GJB2基因增加了27個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，正是因?yàn)檫@些檢測(cè)突變位點(diǎn)的增加才大大提高了耳聾致病基因突變的檢出率。明確病因?qū)εR床治療和病人的管理是非常重要的，因此我們認(rèn)為方法二中增加的檢測(cè)位點(diǎn)是有臨床意義的。

本研究中檢測(cè)出的22例耳聾患者中，GJB 2基因純合突變致病的2例，GJB 2基因復(fù)合雜合突變致病的4例，SLC26A4基因純合突變致病的5例，SLC26A4基因復(fù)合雜合突變致病的10例，12S rRNA純合突變1例，該患者在使用氨基糖甙類藥物后聽(tīng)力完全損失。由檢測(cè)結(jié)果可以看出SLC26A4基因突變致聾在檢測(cè)出明確致聾突變中占68%（15/22）。其中SLC26A4 c.919-2A>G（IVS7-2）是最常見(jiàn)的致病突變（11例）此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[18-20]。此外本研究還檢出多個(gè)非熱點(diǎn)的致病突變位點(diǎn)，如2027T>A（2例）、1240-1243GAGA>AAAG（1例）、1991C>T（3例）、1174A>T（2例）、916 insG （1例）、、1226G>A（1例）、2167C>G （1例）[21-22]。這些錯(cuò)義突變、移碼突變、外顯子剪切點(diǎn)及附近區(qū)域發(fā)生的突變等可能導(dǎo)致該基因無(wú)法準(zhǔn)確翻譯表達(dá)出功能正常的蛋白，導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大及感音神經(jīng)性耳聾的疾病表現(xiàn)。同時(shí)，因?yàn)檫@些相對(duì)少見(jiàn)的致病突變類型沒(méi)有規(guī)律的分布于基因各個(gè)外顯子區(qū)段，簡(jiǎn)單的通過(guò)“突變熱點(diǎn)”篩查來(lái)判斷前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者致聾基因的方法，很可能造成一部分SLC26A4基因突變致聾的前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者的漏診。本次研究中的71例患者就有49例未檢測(cè)出明確已知耳聾致病基因，我們不能排除某些罕見(jiàn)不在我們檢測(cè)范圍內(nèi)的突變導(dǎo)致的耳聾。因此，我們建議針對(duì)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的耳聾患者，如“突變熱點(diǎn)”篩查發(fā)現(xiàn)單雜合突變時(shí)，我們建議對(duì)這類患者進(jìn)行SLC26A4基因全部外顯子的測(cè)序以尋找另一突變位點(diǎn)，以便明確其致聾原因[23]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Fraser GR.The Causes of Profound Deafness in Childhood[J].Ciba Found Symp，1970， 46（15）：1438-1450.

[2] Morton NE. Genetic epidemiology of hearing impairment[J]. Ann N Y Acad Sci，1991，630：16-31.

[3] Marazita ML， Ploughman LM， Rawlings B， et al. Genetic epidemiological studies of early-onset deafness in the US school-age population[J]. Am J Med Genet，1993，46（5）：486-491.

[4] Van Camp G， Willems P，Smith RJ.Nonsyndromic hearing impairment： unparalleled heterogeneity[J]. Am J Hum Genet，1997，6（4）：758-764.

[5] Gardner P， Oitmaa E， Messner A， et al. Simultaneous multigene mutation detdction in patients with sensorineural hearing loss through a novel diagnostic microarray： a new approach for newborn screening follow up [J]. Pediatrics，2006，118（3）：985-994.

[6] Siemering K， Manji SS， Hutchison W， et al. Detection of mutations in genes associated with hearing loss using a microarray based approach[J].J Mol Diagn，2006，8（4）：483-489.

[7] Hilgert N， Smith RJ， Van Camp G. Function and expression pattern of nonsyndromic deafness genes[J].Curr Mol Med， 2009， 9（5）：546-564.

[8] Ouyang XM， Yan D， Yuan HJ， et al. The genetic bases for non-syndromic hearing loss among Chinese[J].J Hum Genet， 2009， 54（3）：131-140.

[9] Lutman ME， Coles RR.Asymmetric sensorineural hearing thresholds in the non-noise-exposed UK population： a retrospective analysis[J]. Clin. Otolaryngol，2009，34（3）：316-321.

[10] Y Chen，M Tudi，J Sun，et al.Genetic mutations in non-syndromic deafoess patients of Uyghur and Han Chinese ethnicities in Xinjiang， China： a comparative study[J]. J Transl Med，2011， 9：154.

[11] Cohn ES， Kelley PM. Clinical phenotype and mutations in connexin 26 （DFNB1/GJB2，the most common cause of childhood hearing loss[J].Am J Med Genet.1999，89（3）：130-136.

[12] P Guilford， S Ben Arab， S Blanchard，et al.A non-syndrome form of neurosensory， recessive deafness maps to the pericentromeric region of chromosome 13q[J]. Nat Genet，1994，6（1）：24-28.

[13] M Trabelsi，W Bahri， M Habibi，et al.GJB2 and GJB6 screening in Tunisian patients with autosomal recessive deafiiess[J].Int J Pediatr OtorhinolaryngoL，2013，77（5）：714-716.

[14] Du W， Guo Y， Wang C， et al.A systematic review and meta-analysis of common mutations of SLC26A4 gene in Asian populations[J]. Int J Pediatr Otorhinolaiyngol，2013，77（10）：1670-1676.

[15] Yuan Y， You Y， Huang D，et al.Comprehensive molecular etiology analysis of nonsyndromic hearing impairment from typical areas in China[J].J Transl Med，2009，7：79.

[16] K Tsukamoto，H Suzuki， D Harada ，et al.Distribution and frequencies of PDS （SLC26A4） mutations in Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct： a unique spectrum of mutations in Japanese[J]. Eur J Hum Genet，2003，11（12）：916-922.

[17] Park HJ， Shaukat S， Liu XZ，et al.global implications for the epidemiology of deafness[J]. J Med Genet，2003，40（4）：242-248.

[18] Kelley PM， Harris DJ， Comer BC， et al. Novel mutations in the connexin 26 gene （GJB2） that cause autosomal recessive （DFNB1） hearing loss[J]. Am J Hum Genet，1998，62（4）：792-799.

[19] 張國(guó)正. 中國(guó)人群特異的耳聾相關(guān)基因SLC26A4基因新變異致病性鑒定及其致聾機(jī)制研究[M]. 河北醫(yī)科大學(xué)，2012.

[20] 戴樸，袁永一，康東洋，等. 1552 例中重度感音神經(jīng)性聾患SLC26A4基因外顯子7和8序列測(cè)定及熱點(diǎn)突變分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（36）：2521-2525.

[21] 袁永一，王國(guó)建，黃德亮，等. 大前庭水管相關(guān)SLC26A4基因熱點(diǎn)突變區(qū)域篩查方案探討[J]. 中華耳科學(xué)雜志，2010，8（3）：292-295.

[22] Wang QJ， Zhao YL， Rao SQ， et al. A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J]. Clin Genet 2007，72（3）：245-254.

[23] 王淑娟，梁鵬飛，王劍，等. 50個(gè)聾兒家庭再生育前的基因突變分析研究[J]. 中華耳科學(xué)雜志，2015，1：97-100.